姚林 吳軍

腎小管上皮及腎臟局部病理改變對(duì)腎結(jié)石形成的臨床價(jià)值分析

姚林 吳軍

目的 分析腎小管上皮及腎臟局部病理改變對(duì)腎結(jié)石形成的臨床價(jià)值。方法 （1）取腎結(jié)石患者腎乳頭活檢標(biāo)本（n=37），鏡下觀察其病理特點(diǎn)，并對(duì)比檢測(cè)腎結(jié)石患者腎組織（n=37）及健康腎組織（n=21）骨橋蛋白、骨形成蛋白-2（BMP-2）、Ⅱ型膠原表達(dá)；（2）體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞，以10 mM草酸或10 mM草酸+200 mg/L一水草酸鈣（COM）結(jié)晶作用12 h，行Western Blotting檢測(cè)其EN01及Cofilin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 （1）腎乳頭標(biāo)本中鈣斑出現(xiàn)率83.8%（31/37）、局部鈣鹽沉積出現(xiàn)率94.6%（35/37）；腎結(jié)石患者骨橋蛋白陽性表達(dá)，腎結(jié)石患者與健康人群腎組織BMP-2及Ⅱ型膠原均呈陰性。（2）10 mM草酸作用12 h后，腎小管上皮細(xì)胞EN 01表達(dá)明顯上升、Cofilin-1表達(dá)明顯下降（P＜0.05），10 mM草酸聯(lián)合COM結(jié)晶作用后，上述變化更為明顯（P＜0.05）。結(jié)論 腎臟局部鈣鹽沉積可能是腎結(jié)石形成的主要途徑，且該途徑與動(dòng)脈鈣化機(jī)制不同；草酸及COM結(jié)晶可能對(duì)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響其EN 01及Cofilin-1的表達(dá)，可能促進(jìn)腎結(jié)石的形成。

腎結(jié)石；腎小管上皮細(xì)胞；鈣鹽沉積；腎臟

腎結(jié)石發(fā)病率約占5%[1]，隨碎石技術(shù)的發(fā)展，其診治均取得了有效突破，但約占1/2患者可能于8年內(nèi)復(fù)發(fā)[2]，這表明現(xiàn)階段臨床尚缺乏有效的腎結(jié)石預(yù)防方案，而其根本原因可能與腎結(jié)石的形成機(jī)制尚不明確有關(guān)。既往有研究認(rèn)為鈣鹽沉積、腎鈣斑沉積可能與腎結(jié)石的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[3]，但鈣鹽沉積的具體機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究重點(diǎn)探討了腎結(jié)石患者的鈣鹽沉積特點(diǎn)，并分析了高濃度尿石成分對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷對(duì)鈣鹽沉積的促進(jìn)作用，具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎乳頭活檢標(biāo)本及腎組織標(biāo)本采集自2013年1月～2013年12月間上饒市立醫(yī)院收治的37例腎結(jié)石患者，男女比例25︰12，年齡9～77歲，平均（43.5±10.2）歲；健康腎組織采集自21例腎癌患者，同期入院，男女比例17︰4，年齡44～71歲，平均（53.9±10.1）歲。人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞株均購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院。

1.2 主要試劑與器械 （1）小鼠抗人OPN抗體、BMP-2抗體、Ⅱ型膠原抗體，均購自Sigma公司；SP試劑盒，DAB試劑盒購自武漢博士德；Vector 22紅外光譜儀，購自Bruker；壓片機(jī)，購自北京先鋒世紀(jì)；（2）DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶等，均購自GIBCO公司；草酸、一水草酸鈣等，均購自上海國藥；二氧化碳孵育箱，購自美國Forma；高速離心機(jī)，購自上海安亭；酶標(biāo)儀，購自芬蘭LABSYSTEMS。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 局部病理觀察 （1）所有腎結(jié)石患者行經(jīng)皮腎鏡取石碎石術(shù)治療，于術(shù)中直視取腎乳頭活檢標(biāo)本，先后行HE及茜素紅染色，鏡下分析鈣鹽沉積情況；（2）所有腎組織石蠟包埋切片，行免疫組化SP法檢測(cè)其骨橋蛋白、BMP-2及Ⅱ型膠原表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)陽性率。

1.3.2 腎小管上皮病理改變 取HK-2細(xì)胞株體外培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后，培養(yǎng)液更換為無血清含鈣DMEM培養(yǎng)液，劃分為3組，各18份，分別不做特殊處理、加入終濃度10 mM草酸、同時(shí)加入10 mM草酸及200 mg/LCOM結(jié)晶，12 h后行Western Blotting檢測(cè)EN 01及Cofilin-1濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用“±s”表示，多組間對(duì)比行F檢驗(yàn)及q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部病理觀察

2.1.1 鏡下觀察 腎結(jié)石患者腎乳頭標(biāo)本中鈣斑出現(xiàn)率、局部鈣鹽沉積出現(xiàn)率均明顯高于健康腎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。鈣鹽沉積特點(diǎn)：在鈣斑部位沉著淺、聚集多，遠(yuǎn)離鈣斑部位及深部髓質(zhì)沉著量明顯較少；鈣鹽沉積少，則集中見于腎小管基底膜，部分向腎間質(zhì)蔓延；電鏡下可見鈣鹽沉積嚴(yán)重位置，其周圍細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞。

表1 鈣斑及局部鈣鹽沉積情況對(duì)比[n（%）]

2.1.2 免疫組化分析 腎結(jié)石患者腎臟組織均呈骨橋蛋白陽性表達(dá)，陽性率明顯高于健康腎臟組織（P＜0.05）；2組均未見BMP-2及Ⅱ型膠原陽性表達(dá)。見表2。

表2 腎臟組織骨橋蛋白、BMP-2及Ⅱ型膠原陽性表達(dá)情況[n（%）]

2.2 腎小管上皮病理改變 經(jīng)草酸或草酸+COM結(jié)晶處理，腎小管上皮細(xì)胞EN 01表達(dá)明顯上升，Cofilin-1表達(dá)明顯下降（P＜0.05），且草酸+COM結(jié)晶處理后，上述蛋白表達(dá)量與單用草酸處理，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 腎小管上皮細(xì)胞EN 01和Cofilin-1半定量檢測(cè)結(jié)果（xs）

表3 腎小管上皮細(xì)胞EN 01和Cofilin-1半定量檢測(cè)結(jié)果（xs）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與單用草酸處理，bP＜0.05

處理方案例數(shù)EN 01Cofilin-1對(duì)照組180.22±0.030.78±0.04草酸180.54±0.03a0.29±0.05a草酸+COM結(jié)晶180.63±0.04ab0.18±0.03abF值25.31131.325 P值0.0000.000

3 討論

腎結(jié)石病因復(fù)雜，目前多認(rèn)為其可能與遺傳、代謝、尿路局部因素、氣候等多種因素有關(guān)[4]，且指出尿液中游離顆粒只有轉(zhuǎn)換為固定顆粒，固定于尿管之中，才可形成結(jié)石，即腎結(jié)石的形成需要一個(gè)原發(fā)病灶[5]。有假說認(rèn)為鈣鹽沉積是腎結(jié)石的早期病變，鈣鹽沉積形成腎鈣斑可為結(jié)石提供生長基礎(chǔ)，且腎鈣斑穿透腎小管上皮細(xì)胞后，還可進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)石的形成[6]。

該假說具備一定的科學(xué)性，但并未有效揭示含鈣物質(zhì)在腎臟局部沉積的機(jī)制?？紤]到腎乳頭的鈣化成分與動(dòng)脈硬化斑塊成分相似，均多為羥基磷灰石，有學(xué)者認(rèn)為腎臟的鈣鹽沉積可能與動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制相同，均為成骨反應(yīng)[7]。但本研究并不支持此輪點(diǎn)，本例中腎結(jié)石患者腎組織中僅骨橋蛋白陽性，但BMP-2及Ⅱ型膠原均陰性，而后兩者均為成骨性細(xì)胞標(biāo)志蛋白。由此推測(cè)，腎局部鈣鹽沉積可能僅與骨橋蛋白的過表達(dá)有關(guān)，該蛋白確有一定成骨作用，在腎臟中多由亨利氏襻、近曲小管等分泌，在健康機(jī)體內(nèi)有抑制腎臟結(jié)晶沉淀的功能[7]。然而腎結(jié)石患者腎小管上皮多受損傷，表面富含草酸鈣晶體，過飽和的草酸鈣晶體可能將骨橋蛋白包裹進(jìn)去，形成潛在的晶體成核位點(diǎn)，導(dǎo)致腎結(jié)石的形成[8]。

由此推測(cè)，腎結(jié)石形成的主要原因之一可能為：高濃度尿石成份導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致上皮細(xì)胞分泌成骨樣蛋白，或分泌特異因子，或在局部促發(fā)成骨性反應(yīng)，導(dǎo)致鈣鹽沉積，再導(dǎo)致腎結(jié)石形成。雖然前述分析提示了局部促發(fā)成骨性反應(yīng)的機(jī)制之一，但本研究同時(shí)顯示，草酸及COM結(jié)晶還可導(dǎo)致腎小管上皮異常分泌釋放其它蛋白，如EN 01及Cofilin-1。EN 01表達(dá)的上調(diào)可能表明細(xì)胞受損[9]，需要通過增加無氧代謝以自我保護(hù)；Cofilin-1則為細(xì)胞分裂必須蛋白，有解聚收縮環(huán)、促進(jìn)細(xì)胞分裂的功能，其含量下降，表明腎臟局部細(xì)胞分裂存在缺陷[10]。然而上述蛋白是否間接影響腎結(jié)石的形成，尚需深入探討，不過本研究結(jié)論已能夠直接證實(shí)，尿中草酸及COM結(jié)晶能夠使腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生病理性改變，異常釋放多種蛋白。

總之，本研究表明腎小管上皮及腎臟局部病理改變可能與腎結(jié)石的形成與發(fā)展有一定關(guān)系，值得深入探討。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.008

江西 334000 江西省上饒市立醫(yī)院外一科 （姚林 吳軍）