何　川　鞏　彪，　王　超　王秀峰，　魏　珉，　楊鳳娟，李　巖，　史慶華，*（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部黃淮海設(shè)施農(nóng)業(yè)工程科學(xué)觀測實驗站，山東泰安 708；作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東泰安 708）

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花椒籽餅熏蒸對番茄根結(jié)線蟲的防效及作用機理

何川1鞏彪1，2王超1王秀峰1，2魏珉1，2楊鳳娟1，2李巖1，2史慶華11，22*
（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部黃淮海設(shè)施農(nóng)業(yè)工程科學(xué)觀測實驗站，山東泰安 271018；2作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東泰安 271018）

摘 要：采用溫室盆栽試驗、GC-MS分析方法以及根結(jié)線蟲二齡幼蟲離體觸殺試驗，研究了花椒籽餅對番茄根結(jié)線蟲的防治效果及其作用機理。結(jié)果表明：土壤生物熏蒸處理30 d后，隨花椒籽餅施用量的增加，土壤中全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效鉀含量均顯著增加，土壤pH值呈上升趨勢，速效磷含量則下降；番茄定植30 d后，隨花椒籽餅施用量的增加，植株根結(jié)指數(shù)逐漸下降，株高、莖粗則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；不同濃度的花椒籽餅浸提液均對根結(jié)線蟲蟲卵孵化產(chǎn)生抑制作用，且隨浸提液濃度的增加抑制作用增強；GC-MS分析結(jié)果表明，花椒籽餅中含有28種揮發(fā)性物質(zhì)，其中具有殺線作用的D-檸檬烯和芳樟醇兩種物質(zhì)之和占總成分的13.53%；不同濃度的D-檸檬烯和芳樟醇均能夠有效抑制根結(jié)線蟲二齡幼蟲的活性，且表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)。綜上，適量施用花椒籽餅不僅能夠改善土壤理化性質(zhì)，促進番茄植株生長，而且能夠有效地抑制根結(jié)線蟲的發(fā)生，其殺線機理主要歸因于花椒籽餅中含有豐富的D-檸檬烯和芳樟醇。

關(guān)鍵詞：花椒籽餅；生物熏蒸；番茄；根結(jié)線蟲；防治效果

何川，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜栽培生理，E-mail：hechuan2008@126.com

番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界各地廣泛栽培的蔬菜作物，隨著日光溫室種植面積的擴大以及復(fù)種指數(shù)的增加，根結(jié)線蟲發(fā)生日益嚴(yán)重（翁偉 等，2013；漆永紅 等，2015）。根結(jié)線蟲（Meloidogyni spp.）侵染植物根系，形成根結(jié)，造成根系發(fā)育不良乃至腐爛，植株地上部表現(xiàn)衰弱、枯死特征（劉維志 等，2003），通常導(dǎo)致作物減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時可達(dá)30%～40%，甚至絕收（彭德良，1998；李戌清 等，2012）。目前針對土傳病害的防治仍以化學(xué)藥劑為主，在過去的幾十年間，溴甲烷作為一種高效土壤熏蒸劑被廣泛使用，但是其對臭氧層具有嚴(yán)重的破壞作用，已被聯(lián)合國環(huán)境保護組織（UNEP）列為限用物質(zhì)，根據(jù)《蒙特利爾議定書哥本哈根修正案》，2015年之后將在世界范圍內(nèi)禁止使用溴甲烷（UNEP MBTOC，2002）。由于高毒、高殘留的化學(xué)藥劑易對土壤環(huán)境造成污染，危害人畜安全，化學(xué)藥劑的使用也受到一定的限制（Abawi & Widmer，2000）。尋找代替化學(xué)藥劑來防治土傳病害的方法已成為目前的研究熱點。

生物熏蒸是指利用植物材料直接或分解過程中釋放出的揮發(fā)物質(zhì)來抑制或殺死土壤中有害生物的方法（李世東 等，2007）。早在1994年，Angus等（1994）用蕓薹屬植物處理土壤，能夠顯著抑制小麥全蝕病的發(fā)生，并將該處理方法命名為生物熏蒸。Monfort等（2007）將蕓薹屬植物作為綠肥施用，使根結(jié)線蟲病得到有效控制。Gong等（2013）使用大蒜秸稈生物熏蒸，對番茄根結(jié)線蟲的防效顯著。Naz等（2015）將紫堇科植物作為綠肥施用，顯著降低了番茄根結(jié)線蟲病的病情指數(shù)。Ngala等（2015）利用十字花科作物芥菜、蘿卜和蕓芥熏蒸土壤，能夠有效控制馬鈴薯孢囊線蟲的群體數(shù)量。

中國是花椒生產(chǎn)大國，其種子可以用來榨油，從而產(chǎn)生大量花椒籽餅。花椒因含有豐富的揮發(fā)性物質(zhì)而具有良好的殺蟲效果，而關(guān)于加工產(chǎn)生的大量花椒籽餅在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究相對較少。本試驗旨在闡明花椒籽餅對番茄根結(jié)線蟲的防控效果及抑病機制，以期為番茄根結(jié)線蟲的綠色防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種為金棚1號，由西安皇冠蔬菜研究所研制。供試花椒籽餅由山東萊蕪?fù)纳锕こ逃邢薰咎峁?，其全氮、全磷、全鉀含量分別為33.04、2.85 g·kg-1和21.53 g·kg-1。

供試根結(jié)線蟲及蟲卵取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站8號溫室感病番茄植株根系，采用Hussey和Barker（1973）的方法收集蟲卵，制備蟲卵懸浮液并標(biāo)定單位體積蟲卵數(shù)。采用改良式貝爾曼漏斗法（劉維志 等，2003）于28 ℃條件下孵化，使用直徑38 μm的網(wǎng)篩分離、收集二齡幼蟲（J2），制備J2懸浮液并標(biāo)定單位體積J2數(shù)，48 h內(nèi)用于試驗。

試驗所使用的D-檸檬烯和芳樟醇均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

試驗于2015年3～6月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站進行。

1.2.1 花椒籽餅生物熏蒸對土壤養(yǎng)分含量的影響

設(shè)在病土（土壤含水量13.45%）中分別添加2% （A1）、4%（A2）、8%（A3）花椒籽餅3個處理，將花椒籽餅與病土混合均勻；以不添加花椒籽餅的常規(guī)田園病土作為空白對照（CK），3次重復(fù)。所有處理均澆透水，然后覆膜熏蒸30 d；采用取土器打取0～15 cm處的土樣，每處理取土約500 g；采用開氏消煮法（Kjedahl）測定土壤全氮、全磷、全鉀含量，采用堿解擴散法測定堿解氮含量，采用NaHCO3浸提-鉬銻抗顯色法測定速效磷含量，采用NH4OAc浸提-火焰光度計法測定速效鉀含量，按土水比1：5（m：V）浸提、采用雷磁PHS-3C pH計測定土壤pH值（鮑士旦，2005）。

1.2.2 花椒籽餅生物熏蒸對番茄生長及根結(jié)線蟲的影響 采用盆栽試驗，將經(jīng)熏蒸處理的土壤分別裝入口徑×底徑×高為21 cm×15 cm×18 cm的盆中，每盆裝5 kg，并定植1株番茄幼苗，每處理6盆，3次重復(fù)，共計18盆。30 d后，每處理隨機選取5株，測定生長指標(biāo)，株高（整個地上部）使用卷尺測定；莖粗（從下往上第4節(jié)位）使用游標(biāo)卡尺測定；植株鮮質(zhì)量采用電子天平稱量。統(tǒng)計根系上肉眼可見的根結(jié)數(shù)，采用Boiteux和Charchar（1996）的方法計算根結(jié)指數(shù)（GI）和相對防治效果。

1.2.3 花椒籽餅浸提液對根結(jié)線蟲蟲卵孵化的影響

將50 g花椒籽餅浸于500 mL水中，25 ℃振蕩提取24 h，過濾濃縮，制成0.5 g·mL-1的花椒籽餅浸提液。在50 mL的三角瓶中加入1 mL蟲卵懸浮液，再分別加入花椒籽餅浸提液和水，最終使花椒籽餅浸提液濃度分別為1%（B1）、2%（B2）、3% （B3）、4%（B4），以清水作對照（CK），5次重復(fù)。將三角瓶置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d和8 d后分別吸取0.1 mL懸浮液，在顯微鏡下統(tǒng)計二齡幼蟲數(shù)量，并計算孵化率及孵化抑制率。

1.2.4 花椒籽餅揮發(fā)性物質(zhì)成分分析 采用電子天平準(zhǔn)確稱取花椒籽餅4 g，置于10 mL頂空瓶中，封口密封，放入自動頂空進樣儀中，于GC-MS QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）中進行GC-MS分析（林佳彬 等，2012；劉春葉 等，2012）。色譜條件：載氣為高純氦氣，流速1 mL·min-1，分流比20∶1；程序升溫初始溫度為50 ℃，以1 ℃·min-1升至60 ℃，然后以5 ℃·min-1升至100 ℃，再以25 ℃·min-1升至240 ℃，保持10 min，總分析時間48 min，進樣口溫度180 ℃。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，掃描范圍50～60 amu，電子倍增器電壓1 342 V。頂空分析條件：柱箱溫度80 ℃，定量管溫度95 ℃，傳輸線溫度110 ℃，樣品瓶平衡時間40 min，樣品瓶加壓時間0.15 min，定量環(huán)填充時間0.15 min。

1.2.5 D-檸檬稀和芳樟醇對根結(jié)線蟲二齡幼蟲活性的影響 試驗在96孔培養(yǎng)板上進行，先用無水甲醇配制成濃度為5、15、25、35、45、55 mL·L-1的D-檸檬烯溶液和芳樟醇溶液，用移液器分別吸取10 μL轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)孔中，然后分別加入90 μL二齡幼蟲懸浮液，搖動混勻，此時混合溶液的濃度分別為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL·L-1，以與配制處理液相同濃度的甲醇溶液為對照（CK），3次重復(fù)。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計二齡幼蟲死亡數(shù)，計算存活率和校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒籽餅生物熏蒸對土壤養(yǎng)分含量的影響

由表1可知，隨著花椒籽餅施用量的增加，熏蒸后土壤中全氮、堿解氮含量均呈現(xiàn)顯著上升趨勢，A1、A2、A3處理的全氮、堿解氮含量比對照分別增加了12.90%、16.67%、26.88%和3.39%、13.27%、21.98%；全磷和速效磷含量則分別呈上升和下降趨勢，與對照相比，A1、A2、A3處理的全磷含量分別增加了1.61%、4.42%、10.44%，而速效磷含量則分別下降了19.05%、12.16%、21.84%；全鉀、速效鉀含量也呈現(xiàn)顯著上升趨勢，A1、A2、A3處理的全鉀、速效鉀含量比對照分別增加了6.99%、14.14%、18.90%和73.44%、168.91%、241.30%?；ń纷扬灥氖┯靡哺淖兞送寥纏H值，隨著施用量的增加土壤pH值顯著增加。

2.2 花椒籽餅生物熏蒸對番茄生長及根結(jié)線蟲的影響

由表2可知，隨著花椒籽餅施用量的增加，番茄植株的株高、莖粗和單株莖葉鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，A1、A2、A3處理的株高和莖粗分別比對照增加了25.64%、24.15%、13.68%和16.96%、19.57%、13.52%。花椒籽餅生物熏蒸土壤對根結(jié)線蟲的防治效果具有明顯的濃度效應(yīng)，各處理的根結(jié)指數(shù)均顯著低于對照，相對防效分別為62.47%、79.99%和94.35%。表明花椒籽餅生物熏蒸不僅能夠促進番茄植株的生長，而且能夠有效防治根結(jié)線蟲。

2.3 花椒籽餅浸提液對根結(jié)線蟲蟲卵孵化的影響

花椒籽餅浸提液對根結(jié)線蟲蟲卵孵化具有顯著的抑制作用（表3），隨著浸提液濃度的增加，蟲卵的孵化率逐漸降低，孵化抑制率逐漸升高；但當(dāng)浸提液濃度達(dá)到2%時，孵化抑制率不再顯著升高，B2、B3、B4處理之間差異不顯著。表明花椒籽餅浸提液中含有抑制根結(jié)線蟲蟲卵孵化的物質(zhì)，且濃度為2%時即可達(dá)到理想的抑制效果。

表1 花椒籽餅生物熏蒸對土壤養(yǎng)分含量的影響

表2 花椒籽餅生物熏蒸對番茄生長及根結(jié)線蟲的影響

表3 花椒籽餅浸提液對根結(jié)線蟲蟲卵孵化的影響

2.4 花椒籽餅揮發(fā)性物質(zhì)成分分析

對花椒籽餅進行GC-MS測定，共檢出28個色譜峰（圖1）。通過對NIST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行檢索，定性分析出28種化合物（表4）?；ń纷扬灀]發(fā)性物質(zhì)主要成分為醛、烯、萜和醇類等，其中含量較高的化合物有乙醛（14.55%）、2，2-二甲基-1，3-二惡唑烷-4，6-二酮（19.61%）、己醛（13.20%）和D-檸檬烯（11.39%）。前人研究表明，D-檸檬烯和芳樟醇能夠有效抑制根結(jié)線蟲的活性（Chatterjee et al.，1982；Sinhababu，1983），本試驗中花椒籽餅的D-檸檬烯和芳樟醇兩種物質(zhì)之和占總成分的13.53%。

表4 花椒籽餅揮發(fā)性物質(zhì)組分及其相對含量

圖1 花椒籽餅揮發(fā)性組分的總離子流圖譜

2.5 D-檸檬烯和芳樟醇對根結(jié)線蟲二齡幼蟲活性的影響

如表5、6所示，D-檸檬烯和芳樟醇均能夠有效滅殺根結(jié)線蟲二齡幼蟲，且具有明顯的濃度效應(yīng)，隨著濃度的升高對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的滅殺效果呈顯著增加趨勢；當(dāng)D-檸檬烯和芳樟醇濃度為55 mL·L-1時，校正死亡率分別為91.08%和88.92%。表明花椒籽餅的殺線作用與其含有D-檸檬烯和芳樟醇有密切關(guān)系。

表5 D-檸檬烯對根結(jié)線蟲二齡幼蟲活性的影響

表6 芳樟醇對根結(jié)線蟲二齡幼蟲活性的影響

3 結(jié)論與討論

生物熏蒸作為一種綠色環(huán)保的土壤消毒措施，不僅能夠抑制或殺死土壤中的有害生物，而且能夠提高土壤肥力，改善土壤理化性質(zhì)。這可能是因為生物熏蒸使用的植物材料在腐解過程中釋放的碳水化合物及一些礦物質(zhì)對土壤微生物群落變化產(chǎn)生了影響，改變了土壤中的生態(tài)環(huán)境，從而引起土壤理化性質(zhì)以及土壤養(yǎng)分的變化（潘明陽，2013）。本試驗中，各熏蒸處理均顯著地改變了土壤養(yǎng)分含量，全氮、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀含量均顯著升高，但速效磷含量有所降低。氮素作為蔬菜生長發(fā)育過程的大量必需元素，是構(gòu)成植物體內(nèi)核酸、葉綠素、酶和蛋白質(zhì)等重要物質(zhì)的一部分（陸景陵，2003）。因此，氮素的供應(yīng)對植物的光合作用和呼吸作用都有影響，從而間接影響植物的生理特性及其產(chǎn)量和品質(zhì)。王艷朋等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，氮素對蔬菜產(chǎn)量的影響可達(dá)48.6%～79.4%。鉀元素雖不是構(gòu)成植物組織的結(jié)構(gòu)成分，但同樣發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。植物的水分吸收、光合作用、酶活性激活等生理活動都離不開鉀元素（Pettigrew，2008）。研究表明，增加鉀元素的供應(yīng)能夠有效緩解連作障礙（范騰飛 等，2013），提高氮、磷元素的利用率（蔡國軍 等，2013）以及蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)（Caretto et al.，2008；陳昆 等，2011），并且能夠抑制氮素過量而對農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生的負(fù)面影響（杜新民 等，2007）。魯如坤等（1996）、周健民（2000）、Shen等（2005）、Macdonald等（2011）的研究表明，我國自20世紀(jì)80年代開始，農(nóng)田中磷素已經(jīng)出現(xiàn)盈余，目前已成為土壤磷素過剩最嚴(yán)重的國家之一，其中中東部等經(jīng)濟發(fā)達(dá)地區(qū)最為顯著。本試驗中土壤全磷含量升高而有效磷含量降低，說明大量的磷被土壤固定，這些磷將在之后的時間里被緩慢釋放，從而可以減少生產(chǎn)中磷肥的施用以及避免植物磷毒害的發(fā)生。

花椒（Zanthoxylum bungeanum）為蕓香科花椒屬，原產(chǎn)我國。花椒的開發(fā)利用已經(jīng)不僅僅是食用、藥用，Ge和Weston（1995）研究表明花椒精油對麥蛾產(chǎn)卵具有顯著地抑制作用，胡兆農(nóng)等（1996）研究表明花椒籽油能夠顯著抑制蚜蟲種群的繁殖。目前關(guān)于直接使用植物材料進行土壤熏蒸來控制土傳病蟲害的方法已經(jīng)非常普遍，其中以蕓薹屬植物為多（Gigot et al.，2013；Hansen & Keinath，2013）。本試驗以花椒籽餅對田園病土進行生物熏蒸，結(jié)果表明其對番茄根結(jié)線蟲的抑制作用具有明顯的濃度效應(yīng)，但是濃度過高（8%）則對番茄植株產(chǎn)生化感抑制作用。魏玲等（2008）研究表明，大蒜秸稈浸提液對番茄具有顯著的化感作用，且對番茄生物量表現(xiàn)為低濃度增加、高濃度降低。另外，花椒籽餅的施入提高了土壤的pH值，而番茄生長所需的最適pH值為6～7（劉世琦，2006），當(dāng)花椒籽餅的施用量為8%時，土壤pH＞7，土壤堿化可能是抑制番茄植株生長的原因之一。生物熏蒸對番茄根結(jié)指數(shù)的影響具有明顯的濃度效應(yīng)，說明花椒籽餅中含有能夠抑制或滅殺根結(jié)線蟲的物質(zhì)，且這種物質(zhì)只有達(dá)到一定濃度時才能達(dá)到理想的殺線效果。

近幾年，一些植物精油成分分析及其生物活性研究取得了較大進展，包括抗菌、抗氧化等（Avato et al.，2000；Isman et al.，2011），并且有關(guān)植物材料揮發(fā)性物質(zhì)對根結(jié)線蟲的滅殺效果也被廣泛報道（Pandey et al.，2000；Andrés et al.，2012；Zotti et al.，2013）。植物精油在抗病蟲方面的效果日益引起人們的關(guān)注，其中一些精油或揮發(fā)性組分通過人工混合后已經(jīng)在農(nóng)藥市場上投入使用（Laquale et al.，2015）。本試驗對花椒籽餅進行GC-MS分析，得到28種組分，其中對根結(jié)線蟲有滅殺作用的D-檸檬烯和芳樟醇之和占總組分的13.53%，前人研究表明用香苦草（Hyptis suaveolens）和羅勒（Ocimum）防治根結(jié)線蟲的作用機理與這兩種物質(zhì)有關(guān)（Chatterjee et al.，1982；Sinhababu，1983），因此花椒籽餅對番茄根結(jié)線蟲的防治作用與其含有D-檸檬烯和芳樟醇有密切關(guān)系。然而目前發(fā)現(xiàn)的多種對線蟲有滅殺作用的物質(zhì)的作用機理還不甚明確（Oka et al.，2000；Lee et al.，2001），有待進一步研究。

綜上所述，適宜用量的花椒籽餅既能夠改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力，促進番茄植株生長，更能夠有效地抑制根結(jié)線蟲的發(fā)生。通過GC-MS分析以及對根結(jié)線蟲二齡幼蟲的離體觸殺試驗，初步證明花椒籽餅對根結(jié)線蟲的作用機理與其含有D-檸檬烯和芳樟醇有關(guān)，至于其含有的其他物質(zhì)是不是也具有殺線蟲活性，有待進一步研究證實。

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Studies on Root-knot Nematode Control Effect and its Mechanism by Biofumigation with Zanthoxylum bungeanum Seed Meal in Tomato Seedlings

HE Chuan1，GONG Biao1，2，WANG Chao1，WANG Xiu-feng1，2，WEI Min1，2，YANG Feng-juan1，2，LI Yan1，2，SHI Qing-hua1，2*
〔1College of Horticulture Science and Engineering，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（Huanghuaihai Region，Ministry of Agriculture），Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，Shandong，China；2State Key Laboratory of Crop Biology，Tai'an 271018，Shandong，China〕

Abstract：This experiment investigated the control effect and mechanism of Zanthoxylum bungeanum seed meal on tomato root-knot nematode via pot expetiment in greenhouse.The results indicated that the concentrations of total nitrogen，total phosphorus，total potassium，available nitrogen，available potassium in soil were significantly increased by biofumigation of Zanthoxylum bungeanum seed meal for 30 days，and the pH value of soil was on the rise tendency，while the content of available phosphorus was decreased. 30 days after fix-planting，the tomato root knot index was gradually decreased along with the increase amount of Zanthoxylum bungeanum seed meal.However，the plant height and stem diameter showed the tendency of first increase then reduce.Different concentrations of Zanthoxylum bungeanum seed meal extracts all had inhibitory effects on hatchability of root knot nematode eggs.The GC-MS analysis showed that there were 28 kinds of volatile substances in Zanthoxylum bungeanum seed meal，about 13.53% of which was D-limonene and linalool.Different concentrations of D-limonene and linalool could effectively inhibit the activity of root-knot nematode second-stage juveniles，and showed obvious concentration effect.Therefore，apropriate application of Zanthoxylum bungeanum seed meal could not only improve soil physical and chemical property，promote tomato growth，but also effectively control the occurrence of root-knot nematode disease.The mechanism was due to the abundant D-limonene and linalool contents in Zanthoxylum bungeanum seed meal.

Key words：Zanthoxylum bungeanum seed meal；Biofumigation；Tomato；Root-knot nematode；Control effect

*通訊作者（

Corresponding author）史慶華，男，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜逆境生理與分子生物學(xué)，E-mail：qhshi@sdau.edu.cn

收稿日期：2015-12-30；接受日期：2016-04-05

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目（2014BAD05B03），國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-25），山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（SDAIT-05-10）