徐修禮，周　珊，白　露，劉家云，馬越云，郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,陜西 西安　710032)

·論著·

ICU患者分離金黃色葡萄球菌的耐藥性及分子流行病學(xué)特征

徐修禮，周珊，白露，劉家云，馬越云，郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,陜西 西安710032)

[摘要]目的了解某院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)金黃色葡萄球菌的耐藥特點(diǎn)及分子流行病學(xué)特征。方法收集2014年1—12月該院ICU分離的金黃色葡萄球菌，進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，采用金黃色葡萄球菌A蛋白(spa)分型及多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法進(jìn)行分型。結(jié)果160株金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)120株(占75.00%)。MRSA對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐藥率均>80%；MSSA對頭孢唑林敏感，對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐藥率分別為62.50%、35.00%、10.00%。spa分型和MLST結(jié)果顯示，120株MRSA主要為ST239-t030、ST239-t037、ST5-t2460 3種型別，其中ST239-t030(105株，87.50%)為主要流行菌株，8個(gè)ICU均有檢出；MSSA存在較多型別，ST59-t437僅在神經(jīng)內(nèi)科(8株)和消化科(2株)檢出，ST6-t701、ST398-t3625、ST398-t1793和ST121-t2092分別僅在神經(jīng)內(nèi)科(7株)、麻醉科(5株)、神經(jīng)外科(4株)和心外科(4株)檢出。結(jié)論該院ICU MRSA分離率較高，以ST239-t030克隆株為主，存在醫(yī)院內(nèi)流行；不同型別MSSA在各科室內(nèi)存在流行趨勢。

[關(guān)鍵詞]重癥監(jiān)護(hù)病房； 金黃色葡萄球菌； spa分型； MLST； 流行病學(xué)； 抗藥性，微生物； 耐藥性

[Chin J Infect Control，2016，15(5)：294-298]

金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的主要病原體，其感染的發(fā)病率和病死率均較高[1]。金黃色葡萄球菌可以引起多種形式感染，如局部化膿性感染、肺炎、假膜性腸炎、心包炎等局部感染，也可引起血流感染、膿毒癥等全身感染；特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，是世界范圍內(nèi)引起醫(yī)院感染的重要病原菌[2]。為了解某院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)分離的金黃色葡萄球菌分子流行病學(xué)特征，筆者收集ICU 2014年分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性分析，并對其進(jìn)行金黃色葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，spa)分型，同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)，為醫(yī)院控制金黃色葡萄球菌感染提供幫助。

1材料與方法

1.1材料

收集2014年全年ICU臨床分離的非重復(fù)金黃色葡萄球菌160株；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。培養(yǎng)基及藥敏紙片購于英國OXOID公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑和溶葡萄球菌素購于上海生工生物工程有限公司，DNA提取試劑盒購自德國Qiagen Company，全自動細(xì)菌藥敏鑒定分析儀Phoenix-100、基因擴(kuò)增儀和電泳儀等購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn)和MRSA鑒定分別采用K-B紙片法和頭孢西丁紙片法，運(yùn)用Phoenix-100和VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定分析儀進(jìn)行檢測和鑒定，按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2014年規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥(R)、中介(I)和敏感(S)。

1.2.2DNA提取依據(jù)Qiagen Company DNA提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行全基因組DNA提取，取15～20個(gè)菌株加入200 μL TE和4 μL溶葡萄球菌素，使菌落充分溶解；37 ℃ 100 r/min溫育1 h，56 ℃ 100 r/min溫育30 min，將裂解完全的液體180 μL轉(zhuǎn)移至EP管，加入25 μL蛋白酶K和200 μL的Buffer AL,振蕩混勻5 s，再加入200 μL無水乙醇振蕩混勻5 s，將溶液加入DNeasy Mini Spin Column中，8 000 r/min 旋轉(zhuǎn)1 min,靜置后棄廢液，用Wash Buffer 1和Wash Buffer 2沖洗，最后用100 μL Elution Buffer以 8 000 r/min旋轉(zhuǎn)1 min將DNA洗脫。

1.2.3spa分型從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出spa基因DNA序列，對應(yīng)兩端保守序列用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物序列：正向引物：5’-TAA AGACGATCCTTCGGTGAGC-3’，反向引物：5’-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3’。以全基因組DNA為模板，在退火溫度為60℃的條件下進(jìn)行PCR操作[3]。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序后的結(jié)果在網(wǎng)站(http://spa.ridom.de)進(jìn)行比對分型。

1.2.4MLST依據(jù)金黃色葡萄球菌7個(gè)管家基因(gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta)對細(xì)菌進(jìn)行分型。PCR反應(yīng)引物及反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[4]，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在網(wǎng)站上(http://www.mlst.net)進(jìn)行比對，確定ST型別。

1.3數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用WHONET 5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，同源性分析應(yīng)用MEGA 5.0軟件進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建樹狀圖。

2結(jié)果

2.1菌株來源及藥敏結(jié)果

160株金黃色葡萄球菌標(biāo)本來源為痰95株，膿性分泌物29株，引流液15株，血13株，組織和尿各3株，腦脊液2株。其中MRSA 120株(75.00%)，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA) 40株(25.00%)。MRSA對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐藥率均>80%；MSSA對頭孢唑林敏感，對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星耐藥率分別為62.50%、35.00%、10.00%。見表1。

表1　ICU金黃色葡萄球菌對常用抗菌藥物的耐藥情況

2.2spa分型及MLST結(jié)果

spa分型將金黃色葡萄球菌菌株分為10個(gè)型別，其中以t030為主(105株，65.63%)，其次為t037(12株，7.50%)，t437(10株，6.25%)，t701(7株，4.38%)，t002(6株，3.75%)，t3625(5株，3.12%)，t2092、t091和t1793(均為4株，7.50%)，t2460(3株，1.87%)。PCR產(chǎn)物分子量在300 bp左右，PCR產(chǎn)物見圖1。對7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分子量在450～600 bp之間。見圖2。MLST共7種型別，分別為ST239(117株，73.13%)，ST59(10株，6.25%)，ST5、ST398(均為9株，11.25%)，ST6(7株，4.38%)，ST121、ST7(均為4株，5.00%)。對金黃色葡萄球菌分型結(jié)果顯示，120株MRSA主要為ST239-t030、ST239-t037、ST5-t2460 3種型別，以ST239為主，117株(117/120，97.50%)，ST239為該院MRSA主要流行型別，特別是ST239-t030(105/120，87.50%)；而MSSA呈現(xiàn)多種分子型別，未發(fā)現(xiàn)主要型別。具體分型見表2。

2.3菌株同源性聚類分析及科室分布

采用MEGA軟件進(jìn)行親緣關(guān)系分析，由樹狀圖可知，MRSA菌株ST239-t030和ST239-t037親緣關(guān)系較近，而MRSA型別與MSSA型別之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，并且同一科室菌株之間親緣關(guān)系未發(fā)現(xiàn)明顯一致。ST239-t030分布廣泛，消化科、心外科、神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科、燒傷科、麻醉科、呼吸科和兒科8個(gè)ICU均有檢出。ST239-t030 MRSA菌株為該院主要流行菌株，且存在醫(yī)院內(nèi)流行。MSSA不同型別分布科室間存在較大差異，如ST59-t437僅在神經(jīng)內(nèi)科(8株)和消化科(2株)檢出；而菌株ST6-t701、

ST398-t3625、ST398-t1793和ST121-t2092分別僅在神經(jīng)內(nèi)科(7株)、麻醉科(5株)、神經(jīng)外科(4株)和心外科(4株)檢出。見圖3、表3。

M:DNA分子量 Marker；1—10泳道分別為spa-t030、spa-t2092、spa-t1793、spa-t037、spa-t3625、spa-t437、spa-t091、spa-t00、spa-t2460、spa-t701

M:DNA分子量 marker；1—7泳道分別為gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta基因

圖2 ICU金黃色葡萄球菌MLST PCR產(chǎn)物電泳圖

Figure 2Electrophoresis of PCR products ofS.aureusMLST in ICUs

表2　ICU 160株金黃色葡萄球菌spa分型及MLST結(jié)果

xh:消化科,xw:心外科,sw:神經(jīng)外科,sn:神經(jīng)內(nèi)科,ss:燒傷科,mz:麻醉科,hx:呼吸科,ek:兒科;

圖3 　ICU 160株金黃色葡萄球菌親緣關(guān)系樹狀圖

3討論

該院ICU 2014年1—12月共分離金黃色葡萄球菌160株，其中MRSA菌株120株(占75.00%)，MSSA菌株40株(占25.00%)，可見MRSA的分離率遠(yuǎn)高于MSSA，且高于全國統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[5]。MRSA對多種抗菌藥物，如青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類和喹諾酮類等均有較高耐藥率，給臨床抗感染治療帶來較大困難。目前，該院分離菌株尚未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素、利奈唑胺和替加環(huán)素耐藥或中介的金黃色葡萄球菌。但近年來，已有報(bào)道對利奈唑胺耐藥及萬古霉素中介的葡萄球菌屬細(xì)菌，應(yīng)引起臨床科室的高度重視；替加環(huán)素是新上市的抗菌藥物，目前仍未有耐藥或中介的葡萄球菌屬細(xì)菌報(bào)道，對其感染具有較為理想的抗菌活性。

ICU中若發(fā)現(xiàn)MRSA感染，需要及時(shí)給予有效的抗感染治療[6]，從而可以較快地控制病情發(fā)展，降低病死率。因此，明確不同醫(yī)院及病區(qū)金黃色葡萄球菌分子型別，可以為臨床醫(yī)生給予有效、及時(shí)治療提供可靠的流行病學(xué)依據(jù)[7]。spa分型是基于spa基因x區(qū)多態(tài)性建立的分型方法，MLST是基于7對管家基因序列測定分析而建立的分型技術(shù)。本研究聯(lián)合spa分型與MLST方法對160株金黃色葡萄球菌進(jìn)行分子分型，以增加菌株型別鑒定的準(zhǔn)確性，同時(shí)便于國際間比對[4]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該院MRSA以ST239-t030為主，所有ICU均有檢出，是主要克隆株；該型別菌株MLST的等位基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)序列號為：2-3-1-1-4-4-3，spa重復(fù)序列編號為：15-12-16-02-24-24。ST239-t030菌株主要在亞洲等地檢出，我國上海、浙江等地區(qū)也有報(bào)道，且該克隆株為多重耐藥菌株[8-9]。因此，ST239-t030菌株的醫(yī)院流行、播散，應(yīng)當(dāng)引起醫(yī)院感染管理部門和臨床科室高度重視。MSSA感染分布顯示，不同病區(qū)間存在差異，如菌株ST6-t701、ST398-t3625、ST398-t1793和ST121-t2092分別僅在神經(jīng)內(nèi)科、麻醉科、神經(jīng)外科和心外科檢出，上述流行趨勢表明，MSSA菌株存在科室內(nèi)傳播，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)科室內(nèi)部感染控制工作[10]。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該院金黃色葡萄球菌ST239-t030克隆株的感染存在醫(yī)院內(nèi)播散趨勢，這可能與不同菌株的地域分布差異有關(guān)。MSSA菌株在各科室內(nèi)部分布也存在差異，可能與科室性質(zhì)不同有一定關(guān)系。我們應(yīng)該加強(qiáng)醫(yī)院感染控制工作，采取有效措施，降低金黃色葡萄球菌醫(yī)院內(nèi)和科室內(nèi)的播散。綜上所述，聯(lián)合兩種分型結(jié)果及藥敏數(shù)據(jù)分析，可以為醫(yī)院控制金黃色葡萄球菌感染流行提供幫助。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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(本文編輯：左雙燕)

Characteristics of antimicrobial resistance and molecular epidemiology ofStaphylococcusaureusisolated from patients in intensive care units

XUXiu-li,ZHOUShan,BAILu,LIUJia-yun,MAYue-yun,HAOXiao-ke(InstituteofClinicalLaboratoryMedicineofPeople’sLiberationArmy,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the characteristics of antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Staphylococcus aureus (S. aureus) in the intensive care units(ICUs) of a hospital. MethodsClinical isolates of S. aureus collected from ICUs between January and December 2014 were identified and performed antimicrobial susceptibility testing, then typed by staphylococcal protein A (spa) typing and multilocus sequence typing (MLST) methods. ResultsOf 160 isolates of S. aureus, 120 (75.00%) were methicillin-resistant S. aureus (MRSA). Resistance rates of MRSA to erythromycin, clindamycin,and levofloxacin were all >80%; methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) were sensitive to cefazolin, resistance rates to erythromycin, clindamycin, and levofloxacin were 62.50%,35.00%, and 10.00% respectively. spa typing and MLST results showed that the main types of 120 isolates of MRSA were ST239-t030,ST239-t037, and ST5-t2460, the major epidemic strains were ST239-t030 (n=105,87.50%), and were isolated from 8 ICUs; MSSA had more types, ST59-t437 were detected only from department of neurology(n=8) and department of digestive diseases(n=2), ST6-t701,ST398-t3625,ST398-t1793, and ST121-t2092 were isolated from departments of neurology(n=7), anesthesiology(n=5), neurosurgery(n=4),and cardiac surgery(n=4)respectively. ConclusionIsolation rate of MRSA in ICUs in this hospital is high, ST239-t030 is the main type, which prevailed in hospital; different types of MSSA have epidemic trends in various departments.

[Key words]intensive care unit; Staphylococcus aureus; staphylococcal protein A typing; spa typing; multilocus sequence typing;MLST; epidemiology; drug resistance,microbial; drug resistance

[收稿日期]2015-12-10

[基金項(xiàng)目]陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014JM4188)

[作者簡介]徐修禮(1962-)，男(漢族)，吉林省樺甸市人，副主任技師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制及醫(yī)院感染分子流行病學(xué)研究。 [通信作者]郝曉柯E-mail:haoxkg@fmmu.edu.cn

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.05.002

[中圖分類號]R181.3+2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-9638(2016)05-0294-05