何麗杰　王　靜　笪宇蓉

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

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維生素D對慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒療效的影響

何麗杰王靜笪宇蓉

(天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

[摘要]目的：探討25羥維生素D3對慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞免疫功能及抗病毒療效的影響。方法：收集慢性乙型肝炎患者70例。采用電化學(xué)發(fā)光法測定血清25羥維生素D、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)血清標(biāo)志物，采用免疫熒光標(biāo)記法測定外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目。根據(jù)血清維生素D水平將患者分為維生素D低水平組、中水平組和高水平組，分別對3組患者給予長效干擾素治療6個月，并于相應(yīng)時間檢測T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目、肝功能、病毒學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：3組患者在性別、年齡兩兩比較上無統(tǒng)計學(xué)差異。隨著血清維生素D水平的升高，CD3+、 CD4+、CD4+/CD8+顯著性升高,而CD8+逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干擾素的治療能明顯改善T細(xì)胞各亞群，并且高水平組改善更明顯。干擾素的治療能明顯改善患者的病毒學(xué)指標(biāo)，高水平組患者能獲得較好的病毒學(xué)應(yīng)答。隨著血清維生素D水平的升高，HBeAg、HBsAg陽性率以及HBV DNA的含量逐漸降低,低水平組與中等水平組、高水平兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。然而不同水平維生素D組，患者的肝功能無明顯差異。結(jié)論：維生素D可能參與慢性乙型病毒性肝炎免疫功能的調(diào)節(jié)并與免疫耐受的形成有關(guān)，高水平的維生素D可以獲得持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答，這可能為慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新的思路。

[關(guān)鍵詞]25羥維生素D3；T淋巴細(xì)胞亞群；病毒學(xué)應(yīng)答

慢性乙型肝炎(慢乙肝)是全球肝病的主要原因,并且其與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險增加明顯相關(guān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球曾感染過HBV的有20億人，其中3.5億人為慢性感染，每年約有100萬人死于HBV相關(guān)的肝衰竭或原發(fā)性肝癌[1]。乙肝病毒感染時病毒的消長和肝臟病變的發(fā)展取決于機(jī)體免疫應(yīng)答的性質(zhì)、強(qiáng)度和范圍，機(jī)體有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答是控制病毒感染的關(guān)鍵，目前關(guān)于HBV感染后機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制還不明確[2]。

維生素D為類固醇衍生物，可以通過食物補(bǔ)充，也可以通過皮膚光照7-脫氫膽固醇異構(gòu)而成；維生素D進(jìn)入血液循環(huán)后與維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)結(jié)合，生成25-羥維生素D3，作為評估機(jī)體維生素D水平最可靠的指標(biāo)[3]。根據(jù)美國內(nèi)分泌學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)[4]，血清25(OH)D3 水平低于50 nmol/L (20 ng/ml)定義為維生素缺乏(Vitamin D deficiency)，介于50～75 nmol/L(20～30 ng/ml)之間定義為維生素D不足(Vitamin D insufficiency)。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，維生素D的很多功能逐漸被很多學(xué)者熟知以及進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與細(xì)胞因子的作用機(jī)制類似,通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路廣泛參與機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[5]。并且機(jī)體內(nèi)某些免疫細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞等，含有維生素D合成酶，可以將血清中低活性的維生素D轉(zhuǎn)換成高活性1,25-(OH)2維生素D3，進(jìn)而通過自分泌或旁分泌在局部參與免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[6]。另外還有學(xué)者研究T淋巴細(xì)胞亞群的體外試驗發(fā)現(xiàn)，維生素D是T淋巴細(xì)胞遷移和歸巢的重要調(diào)節(jié)因素，并且進(jìn)一步參與 T淋巴細(xì)胞的分化和誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生[7,8]。

基于近期對維生素D功能的研究，本研究通過收集未治療的慢性乙型肝炎患者血清和干擾素治療6個月后同期患者的血清，分析患者基線水平的維生素D對慢性乙型肝炎患者免疫功能以及抗病毒治療療效的影響。

1材料與方法

1.1材料μ-Quant 酶標(biāo)分光光度儀(美國 Bio-Tek公司)、ELISA試劑盒(美國Abcam公司)，T淋巴細(xì)胞分選磁珠(美國 BD公司)。

1.2血清標(biāo)本收集70例慢性乙型肝炎患者來自2014年6月至2015年1月天津市第五中心醫(yī)院收治的患者，男42例，女28例，患者基本信息見表1。所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和感染病學(xué)分會2010年制訂的《乙型肝炎防治指南》 中慢性乙型病毒性肝炎標(biāo)準(zhǔn)[9]，排除合并其他病毒性肝炎、酒精性肝炎以及其他慢性肝病，無合并急慢性感染、冠心病、糖尿病、腎臟疾病等。納入患者之前均未接受任何抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑治療，給予長效干擾素肌內(nèi)注射治療，每次6 MIU，每2 d一次，分別于0個月、1個月、3個月、6個月檢測患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。同時檢測患者肝功血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)以及病毒學(xué)指標(biāo)表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、病毒顆粒(HBV-DNA)。

1.3實驗分組根據(jù)血清25-羥維生素D，將所有患者分為3組，即低水平組：血清25-羥維生素D<20 ng/ml；中等水平組：20 ng/ml≤25-羥維生素D<30 ng/ml；高水平組：25-羥維生素D≥30 ng/ml。

1.4實驗方法所有患者在對應(yīng)時間于清晨空腹采取5 ml，EDTA抗凝血，1 000 r/min，離心15min，淋巴細(xì)胞分離液分選淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞磁珠分選相應(yīng)亞群T淋巴細(xì)胞。肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL采用日本Olympus全自動生化分析儀檢測,試劑由羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供。病毒學(xué)指標(biāo)HBsAg、HBeAg、HBV-DNA檢測采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，儀器購自美國伯樂公司生產(chǎn)Icycler IQ，試劑由深圳匹基生物工程股份有限公司提供。

2結(jié)果

2.1各組基本信息統(tǒng)計3組患者年齡、性別、基線水平的肝功能以及病毒學(xué)指標(biāo)，結(jié)果表明3組之間的年齡、性別比之間無明顯差異，治療前不同25羥維生素D3水平組患者肝功能無明顯差異，而病毒學(xué)指標(biāo)HBsAg和HBeAg陽性例數(shù)以及HBV DNA 含量25羥維生素D3低水平組和中水平組較高水平組要高，有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2各組T淋巴細(xì)胞亞群的比較流式細(xì)胞技術(shù)檢測3組T淋巴細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+隨著25羥維生素D3水平的升高，免疫細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，高水平組較低水平組和中水平組均有明顯差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而CD8+亞群細(xì)胞數(shù)結(jié)果則相反，高水平組較低水平組和中水平組均有差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CD4+/CD8+比值隨著25羥維生素D3水平的升高逐漸增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。患者給予長效干擾素治療后于1個月、3個月和6個月檢測患者T淋巴細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞亞群均有不同程度的改善，CD3+、CD4+隨著治療時間的延長逐漸升高至恢復(fù)正常，而CD8+逐漸降低，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)25羥維生素D3高水平組T細(xì)胞亞群改善較其他兩組明顯。具體結(jié)果見圖1、2。

表1各組患者臨床基本資料

Tab.1Baseline characteristics of each group

LowvitaminDgroupMidvitaminDgroupHighvitaminDgroupPvaluen203416M/F11/822/129/8Years35.500±4.75033.180±5.62030.630±7.5600.440ALT88.230±7.01085.740±6.83089.340±8.7800.360AST40.310±6.24038.370±8.21039.440±6.8900.470TBIL17.230±4.72016.980±3.84017.010±4.0500.180HBsAg(positive,n)203190.001HBeAg(positive,n)173080.001HBVDNA(log10copies/ml)7.030±2.3006.450±1.8904.890±1.5600.003

Note：Pvalue：High vitamin D group vs low vitamin D group.

圖1　各組CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群治療前和治療6個月的含量檢測流式圖Fig.1　Results of peripheral blood CD4+ and CD8+T lymphocyte subsets before and after 6 months treatment in each group

圖2　各組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果±s)Fig.2　Results of peripheral blood T lymphocyte subsets in each ±s)Note: *.P<0.01.

2.2各組治療后肝功能的變化3組患者給予長效干擾素抗病毒治療6個月后，分別與1個月、3個月和6個月復(fù)查肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL，3組患者肝功能較治療前均有明顯改善，各組之間ALT、AST、TBIL的變化無明顯差異，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

2.3各組治療后病毒學(xué)指標(biāo)的變化3組患者給予長效干擾素抗病毒治療6個月后，分別于1個月、3個月和6個月復(fù)查病毒學(xué)指標(biāo)HBsAg、HBeAg和HBV DNA含量，發(fā)現(xiàn)隨著干擾素的治療，3組患者HBsAg和HBeAg陽性例數(shù)均有減少，并且治療6個月后高水平組e抗原陽性患者均有e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換，而s抗原陽性患者有一半患者轉(zhuǎn)陰，HBV DNA含量明顯降低，有一部分患者檢測不到HBV DNA。結(jié)果見圖4、表2。

圖3　各組治療后肝功能變化Fig.3　Improvement of liver function during each group

圖4　各組的HBV DNA的變化Fig.4　Improvement of HBV DNANote: *.P<0.01.

表2各組治療后病毒學(xué)指標(biāo)的變化

Tab.2Improvement of virus serological markers during each group

LowvitaminDgroupMidvitaminDgroupHighvitaminDgroupP1P2BeforetreatmentHBsAg(positive,n)203190.0010.0001HBeAg(positive,n)173080.0010.0007OnemonthHBsAg(positive,n)192870.0010.0001HBeAg(positive,n)152870.0010.0007ThreemonthsHBsAg(positive,n)172550.010.001HBeAg(positive,n)102030.010.001SixmonthsHBsAg(positive,n)162330.0010.0001HBeAg(positive,n)91500.0010.0001

Note：P1 value:High vitamin D group vs low vitamin D group;P2 value:High vitamin D group vs mid vitamin D group.

3討論

慢性乙型病毒性肝炎是一種異質(zhì)性疾病，不同患者病毒復(fù)制水平高低不等，肝組織炎癥輕重各異，反映機(jī)體對病毒不同的免疫狀態(tài)[1]。乙型肝炎患者普遍存在細(xì)胞免疫功能紊亂。外周血T淋巴細(xì)胞亞群是反映機(jī)體免疫狀態(tài)和功能的指標(biāo)，對某些疾病的輔助診斷、分析發(fā)病機(jī)制、觀察療效及監(jiān)測預(yù)后有重要意義。乙型肝炎患者中T細(xì)胞免疫主要對HBV清除和控制、肝組織病理損傷方面發(fā)揮作用，對疾病的轉(zhuǎn)歸有重要影響[10]。

T淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體關(guān)鍵性免疫活性細(xì)胞，是目前臨床上最常用的反映免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)，根據(jù)T細(xì)胞表面CD分子表達(dá)可將成熟的T淋巴細(xì)胞分為CD4+和CD8+細(xì)胞兩大類，每一類均為非均一的細(xì)胞群體，進(jìn)一步可分為效應(yīng)性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，T細(xì)胞總數(shù)或不同T細(xì)胞亞群的絕對數(shù)或比值發(fā)生改變，可視為免疫異常，可能與某些疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，而CD4+/CD8+比值則反映了機(jī)體免疫功能有無紊亂。

目前研究發(fā)現(xiàn)，維生素D的水平與人體免疫功能存在一定聯(lián)系，且被認(rèn)為屬于神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)激素，能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞進(jìn)行分化，調(diào)控活化T細(xì)胞或使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞遷移和歸巢，并且促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化和誘導(dǎo)免疫耐受[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體的維生素D的水平與慢性肝病之間有一定聯(lián)系。Petta等[13]研究表明較高水平的維生素D可以預(yù)示患者抗丙肝治療能獲得較好的或是持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答。另外還有學(xué)者研究慢性乙型肝炎患者機(jī)體維生素D水平，發(fā)現(xiàn)高病毒載量患者一般機(jī)體維生素D明顯不足，甚至缺乏，同時還發(fā)現(xiàn)那些高水平維生素D水平患者進(jìn)行抗病毒治療后能獲得更好的e抗原、s抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換；然而研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體維生素D的含量與慢性肝病患者肝功能的改善無明顯影響[14-16]。

本研究對25羥維生素D3對慢性乙型肝炎患者免疫功能及抗病毒療效的影響進(jìn)行臨床研究。研究發(fā)現(xiàn)25羥維生素D3低水平組、中水平組比高水平組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+逐漸升高，而CD8+逐漸降低，這一結(jié)果表明慢性乙型肝炎患者機(jī)體維生素D的水平與機(jī)體的免疫狀態(tài)或是免疫異常存在一定聯(lián)系。并且給予患者長效干擾素抗病毒治療后，不同維生素D水平組患者的免疫狀態(tài)均有改善，并且高水平組改善較另外兩組明顯一些。這一結(jié)果表明機(jī)體內(nèi)高水平的25羥維生素D3可能促進(jìn)機(jī)體T淋巴細(xì)胞的分化、遷移，從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受，減少炎癥因子對機(jī)體的損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)高水平組患者的病毒載量以及e抗原陽性和s抗原陽性患者數(shù)較低水平組和中水平組要低，并且隨著抗病毒的治療，我們發(fā)現(xiàn)高維生素D水平組患者能更好地獲得病毒學(xué)應(yīng)答，HBV病毒載量明顯降低甚至有些患者檢測不到病毒載量，e抗原的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率以及s抗原的清除率也較低水平組和中水平組高。而3組患者之間的肝功能無明顯差異，這表明維生素D的水平與慢性肝病肝功能的狀態(tài)具有相關(guān)性。這些實驗結(jié)果與以上學(xué)者研究是一致的，表明維生素D的水平可能與慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制以及抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答有一定聯(lián)系。機(jī)體較高水平的25羥維生素D3患者能夠獲得較好的抗病毒治療效果，可能是因為較高的25羥維生素D3水平能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向受損的以及炎癥反應(yīng)較重的肝組織遷移，從而改善機(jī)體的損傷，同時較高的25羥維生素D3水平能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫耐受，減少機(jī)體炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，維生素D作為微量元素，具有很多功能，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，對各種疾病狀態(tài)下的免疫狀態(tài)有一定的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)25羥維生素D3對慢性乙型肝炎患者T淋巴細(xì)胞亞群和病毒學(xué)應(yīng)答有一定影響，這可能為慢性乙型病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

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[收稿2015-10-15修回2015-10-29]

(編輯倪鵬)

Effect of serum Vitamin D levels on cellular immunity and antiviral effects in chronic hepatitis B patients

HELi-Jie,WANGJing,DAYu-Rong.

TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

[Abstract]Objective:To study the effect of vitamin D on peripheral blood T lymphocyte subsets and antiviral effects in chronic hepatitis B patients.Methods: The clinical data for 70 patients with chronic hepatitis B were analyzed.These patients were divided into three groups based on serum 25-hydroxy vitamin D level.Serum 25-hydroxy vitamin D was determined by electrochemical luminescence,and hepatitis B virus serological markers was determined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction.Subsets of T lymphocytes were determined by flow cytometry.Results: The age and ratio of gender had no difference during these three groups. The proportion of CD3+,CD4+T lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+ increased (P< 0.05) significantly as the increase of 25-hydroxy vitamin D levels,but the proportion of CD8+ decreased.Interferon treatment could improve the T cells subgroup,and high level of serum 25-hydroxy vitamin D group improved more obviously.The treatment of interferon could obviously improve the hepatitis B virus serological markers,high level group of serum 25-hydroxy vitamin D could obtain better virological response.The positive of HBeAg,HBsAg and the titer of HBV DNA decreased with the increase of serum vitamin D,and the difference between the high and low level of 25-hydroxy vitamin D groups were significant.However,there were no significant difference between 3 groups of serological markers of liver function.Conclusion: Vitamin D may play a part in the immune tolerance in the nature course of chronic HBV infection,and high levels of vitamin D may be able to achieve sustained virological response.This findings may shed light on the immunotherapy of chronic hepatitis B.

[Key words]25-hydroxy vitamin D3；T lymphocyte subsets；Virological response

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.029

作者簡介：何麗杰(1986年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫學(xué)方面的研究,E-mail：helijie39@163.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：笪宇蓉(1971年-)，女，博士，副研究員，主要從事細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)通路與自身免疫性疾病，E-mail：dayr@tijmu.edu.cn。

中圖分類號R512.6+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0729-05