公　偉　劉　丹　岳會(huì)敏　宋玉仙　侯亞義

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 兒科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008)

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冬蟲(chóng)夏草菌絲體提取物抑制順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷

公偉劉丹①岳會(huì)敏①宋玉仙①侯亞義①

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院 兒科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210008)

[摘要]目的：探討冬蟲(chóng)夏草菌絲體(Hirsutella sinensis mycelium，HSM)提取物對(duì)順鉑(CDDP)誘導(dǎo)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)損傷的影響及可能的調(diào)控機(jī)制。方法：體外實(shí)驗(yàn)分5組：正常對(duì)照組、順鉑誘導(dǎo)的損傷模型組及低、中、高劑量的HSM干預(yù)組。RTEC經(jīng)HSM預(yù)處理2 h后加CDDP刺激，24 h后收取細(xì)胞，分別采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、Real-time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因、炎性因子及模式識(shí)別受體的相對(duì)表達(dá)量。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組、CDDP誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型組及HSM治療組，分別取腎組織進(jìn)行HE染色及提取RNA和相關(guān)基因mRNA水平的檢測(cè)。結(jié)果：HSM預(yù)處理可緩解CDDP誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，并抑制BAX與Caspase-9；同時(shí)降低TNF-α和TLR4的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則顯示HSM可有效緩解CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎小管損傷。結(jié)論：HSM可以降低RTEC凋亡、減輕炎癥以改善CDDP誘導(dǎo)的RTEC損傷。

[關(guān)鍵詞]冬蟲(chóng)夏草菌絲體；順鉑；腎小管上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

順鉑(CDDP)是臨床化療的常用藥，用于多種實(shí)體腫瘤的治療且效果顯著，然而，CDDP的療效受腎毒性限制[1,2]。CDDP經(jīng)靜脈注射后會(huì)在腎小管富集，誘發(fā)近端小管上皮細(xì)胞(RTEC)凋亡與炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管損傷[3,4]。因此，有效緩解CDDP腎毒性是提高化療質(zhì)量的重要措施。冬蟲(chóng)夏草菌絲體(Hirsutella sinensis mycelium，HSM)提取物是從天然蟲(chóng)草中獲取的人工發(fā)酵制品，以多糖為主要活性物質(zhì)[5]。研究指出HSM能顯著提高免疫力、抗疲勞與降血脂等功效，尤其對(duì)多種原因引發(fā)的腎損傷具有良好的防護(hù)作用，但具體作用機(jī)制尚未闡明[6,7]。本研究通過(guò)探討HSM對(duì)順鉑誘導(dǎo)的RTEC損傷的影響及其可能的作用機(jī)制，為臨床緩解CDDP腎毒性提供新思路。

1材料與方法

1.1材料鼠源RTEC購(gòu)于齊式生物科技有限公司，CDDP購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，HSM購(gòu)自南京中科集團(tuán)股份有限公司(每200 mg冬蟲(chóng)夏草菌絲體中含蟲(chóng)草多糖50 mg)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)，Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒(BD公司)，SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組將傳代培養(yǎng)的RTEC分為以下5組：(1)空白對(duì)照組：正常RTEC；(2)模型組：以10 ng/ml CDDP處理RTEC；(3)低劑量干預(yù)組：25 μg/ml HSM+10 ng/ml CDDP處理RTEC；(4)中劑量干預(yù)組：50 μg/ml HSM +10 ng/ml CDDP處理RTEC；(5)高劑量干預(yù)組：100 μg/ml HSM +10 ng/ml CDDP處理RTEC。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)將RTEC細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至80%以上后，用0.25%胰酶(含EDTA)進(jìn)行消化并傳代培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RTEC按照5×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl完全培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后，分別用PBS或者不同濃度的HSM(12.5、25、50、100、200 μg/ml)處理細(xì)胞。24 h后，移除培養(yǎng)液，重新添加含10% CCK-8的培養(yǎng)基至每孔中繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育3 h后在酶標(biāo)儀上450 nm處檢測(cè)吸光值(OD值)并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=(處理組平均OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。將RTEC細(xì)胞按照2×105個(gè)/ml接種于12孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組，分別給予25、50、100 μg/ml的HSM處理2 h后，再添加10 ng/ml CDDP處理24 h。收取細(xì)胞，PBS清洗2次后用binding buffer重懸，分別添加FITC-Annexin V與PI各5 μl，避光孵育5 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)引物經(jīng)Primer 5設(shè)計(jì)并由上海英駿公司合成，引物序列見(jiàn)表1。按照Trizol試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，取1.5 μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明將其反轉(zhuǎn)成cDNA。使用Sybr Green PCR Master Mix和Applied Biosystems (Foster,CA,USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型的構(gòu)建及HSM的體內(nèi)干預(yù)SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物所。實(shí)驗(yàn)分三組：正常對(duì)照組，腹腔注射0.9%的生理鹽水0.2 ml；模型組，腹腔注射10 mg/kg的順鉑-生理鹽水溶液(濃度為1 g/L)；HSM治療組，給以腹腔注射10 mg/kg順鉑-生理鹽水，同時(shí)每天灌胃給藥200 mg/kg。注射藥物72 h后處死小鼠，留取腎臟組織，4%多聚甲醛固定，同時(shí)部分組織液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2結(jié)果

2.1HSM對(duì)RTEC的細(xì)胞活力的影響HSM濃度分別為12.5、25、50、100 μg/ml時(shí)，RTEC的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異，當(dāng)HSM濃度為200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活力(%)降為0.85 ± 0.14，差異具有顯著性(P<0.05)，可見(jiàn)HSM在≤ 100 μg/ml的濃度范圍內(nèi)不影響細(xì)胞的正?；盍?，此后實(shí)驗(yàn)所用濃度均在此范圍內(nèi)。見(jiàn)圖1。

2.2HSM緩解CDDP誘導(dǎo)的RTEC細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞凋亡率(%)為54.27 ± 0.38，而高劑量HSM處理組凋亡率(%)降為44.33 ± 2.4，可見(jiàn)HSM預(yù)處理可減少RTEC細(xì)胞的晚期凋亡。同時(shí)，與模型組相比，低、中、高劑量HSM預(yù)處理組Bcl-2的mRNA表達(dá)上調(diào)，同時(shí)BAX、Caspase-9表達(dá)降低，高劑量效果更為明顯。見(jiàn)圖2。

2.3HSM抑制CDDP誘導(dǎo)的RTEC炎癥反應(yīng)本研究同時(shí)關(guān)注HSM對(duì)RTEC炎癥反應(yīng)的效果。結(jié)果顯示，CDDP可促進(jìn)RTEC產(chǎn)生TNF-α和TLR4，HSM預(yù)處理能劑量依賴地抑制TNF-α與TLR4的表達(dá)，高劑量組具有顯著性差異。見(jiàn)圖3。

表1引物序列表

Tab.1Table of PCR primer sequences

GenesSequences5'-3'LengthBcl-2F:ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC120bpR:GGTATGCACCCAGAGTGATGCBAXF:CCGGCGAATTGGAGATGAACT229bpR:CCAGCCCATGATGGTTCTGATCaspase-9F:TCAGGGGACATGCAGATATGG196bpR:TTGGCAGTCAGGTCGTTCTTCTNF-αF:CCCTCACACTCAGATCATCTTCT61bpR:GCTACGACGTGGGCTACAGTLR4F:CCTGATGACATTCCTTCT255bpR:AGCCACCAGATTCTCTAAGAPDHF:AACGACCCCTTCATTGAC191bpR:TCCACGACATACTCAGCAC

圖1　CCK-8檢測(cè)HSM對(duì)RTEC細(xì)胞活力的影響Fig.1　Effects of HSM on RTEC cell viabilityNote: *.P<0.05 vs control.

圖2　HSM對(duì)CDDP誘導(dǎo)的RTEC細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡基因表達(dá)的影響Fig.2　Effects of HSM on apoptosis and gene-associated with apoptosis in CDDP-treated RTECNote: A.Apoptosis measured by Flow Cytometry;B-D.mRNA expressions of Bcl-2 (B),BAX (C) and Caspase-9 (D).**.P<0.01,***.<0.001 vs control;#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001 vs CDDP-treated group.

圖3　HSM對(duì)CDDP作用下RTEC表達(dá)TNF-α和TLR4的影響Fig.3　Effects of HSM on expressions of TNF-α and TLR4 induced by CDDPNote: ***.P<0.001 vs control;##.P<0.01 vs CDDP-treated group.

圖4　HSM對(duì)CDDP誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷的影響Fig.4　Effects of HSM on CDDP-induced acute kidney injuryNote: A.Kidney sections were subjected to H&E staining (×400);B-C.mRNA expressions of TLR4 (B) and TNF-α in kidney tissue.**.P<0.01,***.<0.001 vs control;#.P<0.05,##.P<0.01 vs CDDP-treated group.

2.4HSM緩解順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷通過(guò)腹腔注射順鉑制備小鼠的急性腎損傷模型，可見(jiàn)腎小管病變，表現(xiàn)為小管細(xì)胞腫脹，上皮細(xì)胞刷狀邊緣缺失及管腔擴(kuò)張，同時(shí)可見(jiàn)蛋白管型。而HSM治療組腎臟小管病變明顯改善。另外，TLR4及炎性因子TNF-α在治療組小鼠腎臟中的表達(dá)較模型組顯著降低，提示HSM能夠緩解順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷。見(jiàn)圖4。

3討論

CDDP是臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤化療藥物之一，常用于多種實(shí)體腫瘤的治療且療效顯著，其療效與用藥劑量成正比，然而增加藥物劑量會(huì)導(dǎo)致腎毒性，包括近端小管損傷、氧化應(yīng)激、炎癥和腎臟血管損傷等。腎毒性并發(fā)癥的臨床發(fā)病率高達(dá)30%，成為化療用藥的極大障礙，緩解CDDP引發(fā)的腎損傷，對(duì)提高化療效果有著重要意義[8-11]。病理研究表明，因腎小管上皮細(xì)胞RTEC具有的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，CDDP經(jīng)靜脈注射后會(huì)在腎小管富集，誘發(fā)RTEC損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡進(jìn)而壞死、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)等[4,12,13]。冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明人工發(fā)酵的冬蟲(chóng)夏草菌絲體HSM在腎臟疾病的治療方面有療效，但分子機(jī)制尚未明確[14]。本研究針對(duì)HSM在CDDP誘導(dǎo)的小管細(xì)胞損傷方面的影響進(jìn)行了探討。

CDDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡伴隨著一系列凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。Bcl-2與BAX分別是Bcl-2家族中抗凋亡與促凋亡蛋白中的核心因子，Bcl-2/BAX比例下降可促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，其調(diào)控途徑為通過(guò)Bcl-2家族蛋白活化，釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等，最終激活Caspase家族，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15,16]。在本研究中，HSM預(yù)處理組可明顯緩解CDDP誘導(dǎo)的晚期凋亡，在對(duì)基因水平的分析中發(fā)現(xiàn)，HSM可有效調(diào)節(jié)Bcl-2/BAX之間的平衡，進(jìn)而抑制下游Caspase-9的表達(dá)，減少細(xì)胞死亡。

炎癥是RTEC損傷的重要方面，研究證實(shí)，CDDP誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠中TNF-α明顯增多，并且來(lái)源于RTEC而非炎癥細(xì)胞[17]。同時(shí)，作為免疫樣細(xì)胞，RTEC表達(dá)模式識(shí)別受體TLR4，CDDP可通過(guò)TLR4加劇小管細(xì)胞損傷[18]。而HSM可以劑量依賴的方式抑制CDDP誘導(dǎo)的RTEC表達(dá)TNF-α和TLR4，高劑量組具有顯著差異，提示HSM具有抑炎的效果。已有文獻(xiàn)證實(shí)冬蟲(chóng)夏草菌絲體在改善慢性腎臟病大鼠的微炎癥反應(yīng)方面具有優(yōu)勢(shì)，這與我們的研究結(jié)果一致[19]。

為了進(jìn)一步確認(rèn)HSM對(duì)小管損傷的影響，本研究制備了順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型，在體內(nèi)觀察HSM對(duì)小管損傷的療效。實(shí)驗(yàn)表明，HSM可以有效緩解順鉑誘導(dǎo)的小鼠腎臟小管細(xì)胞腫脹及管腔擴(kuò)張，減少上皮細(xì)胞刷狀邊緣缺失，減少蛋白管型，提示HSM對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎損傷具有潛在的治療效果。

本研究通過(guò)CDDP誘導(dǎo)的RTEC損傷模型，探討了人工發(fā)酵的冬蟲(chóng)夏草菌絲體HSM對(duì)腎小管細(xì)胞損傷的影響，發(fā)現(xiàn)HSM可有效緩解CDDP誘導(dǎo)的RTEC損傷，提示其對(duì)CDDP腎毒性以及腎臟病的防治具有重要的研究?jī)r(jià)值。然而，本研究中HSM在不同劑量所表現(xiàn)出的效果差異及涉及的信號(hào)通路尚未揭示，還需進(jìn)一步深入研究以闡明HSM的作用機(jī)制。

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[收稿2015-08-05修回2015-10-16]

(編輯倪鵬)

Effect of Hirsutella Sinensis Mycelium on Cis-dia minodichloroplatin-induced injury of renal tubular epithelial cell

GONGWei,LIUDan,YUEHui-Min,SONGYu-Xian,HOUYa-Yi.

NanjingKeyLaboratoryofPediatrics,NanjingChildrenHospital,AffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China

[Abstract]Objective:To investigate the effects of Hirsutella Sinensis Mycelium (HSM) on Cis-dia minodichloroplatin (CDDP)-induced renal tubular epithelial cell (RTEC) injury and its possible mechanism.Methods: RTEC was divided into five groups:control group,CDDP-treated group and low,middle,high doses of HSM pre-treated groups.After pre-treated with HSM 2 h,RTEC was then treated with CDDP for 24 h.Cell apoptosis was detected by Annexin V/PI double staining flow cytometry,and the mRNA expressions of apoptosis-related genes,inflammatory cytokine TNF-α and pattern recognition receptor TLR4 were detected by Real-time PCR.Besides,for in vivo experiments,mice model of acute kidney injury (AKI) was induced by i.p.injection with CDDP,and the HSM was given by gavage once a day with a dose of 200 mg/kg.Results: HSM pre-treatment increased the mRNA expression of Bcl-2 while inhibited the BAX and Caspase-9.Besides,HSM reduced the inflammatory factor TNF-α and pattern recognition receptor TLR4.Furthermore,HSM-treated mice subjected to AKI showed reduced symptoms of tubule injury.Conclusion: HSM can alleviate the RTEC injury induced by CDDP.

[Key words]Hirsutella sinensis mycelium；Cis-dia minodichloroplatin；Renal tubular epithelial cell；Apoptosis

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.015

作者簡(jiǎn)介：公偉(1986年-)，女，博士，主要從事藥物免疫與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究，E-mail:viwi1986@sina.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：侯亞義(1960年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞與分子免疫方面的研究，E-mail:yayihou@nju.edu.cn。

中圖分類號(hào)R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0669-04

①南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院和生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210093。