王子航　陳麗艷　米旭光

(延邊大學(xué)臨床學(xué)院，延吉133002)

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p21蛋白激活激酶4在三陰乳腺癌增殖中的作用及機(jī)制研究①

王子航陳麗艷②米旭光③

(延邊大學(xué)臨床學(xué)院，延吉133002)

[摘要]目的：探討p21蛋白激活激酶4(PAK4)在三陰乳腺癌細(xì)胞增殖存活中的作用機(jī)制。方法：在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體，熒光定量法和免疫印跡分析檢測(cè)PAK4 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量變化；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞存活率的影響；細(xì)胞周期分析檢測(cè)，轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；免疫印跡分析，轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響。結(jié)果：干擾內(nèi)源PAK4表達(dá)后，三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖率分別下降(36.51±4.24)%和(38.54±5.43)%，G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著增加到(66.40±2.82)%和(72.01±3.13)%，ERK1/2磷酸化顯著降低；ERK通路抑制劑PD98059處理后，三陰乳腺癌BT549細(xì)胞的增殖率顯著下降(46.41±7.16)%。結(jié)論：PAK4在三陰乳腺癌增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其促增殖作用是通過ERK通路實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]三陰乳腺癌；PAK4；增殖；ERK

三陰乳腺癌具有侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展快、生存時(shí)間短的臨床特點(diǎn)[1]，并且雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2在三陰乳腺癌中表達(dá)均為陰性[2]，因此內(nèi)分泌治療和分子靶向治療無效，化療是其主要的治療手段，僅約20%的三陰乳腺癌患者對(duì)化療敏感[3]。由此可見，三陰乳腺癌預(yù)后較差可能與其缺乏有效的治療手段有關(guān)，因此針對(duì)三陰乳腺癌治療的新靶點(diǎn)尋找及相應(yīng)藥物的開發(fā)顯得尤為重要。本文旨在探討PAK4作為三陰乳腺癌細(xì)胞治療靶點(diǎn)的可能性及相應(yīng)的抑癌機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑耗材細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))、Lipofecta-mineTM2000(Life Technologies公司，美國(guó))、PVDF膜(Millipore，德國(guó))、鼠抗PAK4、GAPDH和HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(CST，美國(guó))、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4干擾載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、MTT(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))、SYBR GREEN Master mix(Roche，瑞典)、其他常規(guī)試劑(北京化工，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、BT549細(xì)胞，含10%新生牛血清(四季青生物公司，中國(guó))的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)， 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)傳代。

1.2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體法)在轉(zhuǎn)染前24 h，1×106/孔在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不含抗生素不含血清的不完全培養(yǎng)液。將待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒按說明書加入到250 μl無雙抗血清培養(yǎng)液中，吹打混勻。同時(shí)，將5～10 μl脂質(zhì)體加入到250 μl無雙抗血清培養(yǎng)液中，吹打混勻。室溫靜置5 min后，將兩者混勻。室溫孵育20 min后，將混合液加入到待轉(zhuǎn)孔中并混勻。培養(yǎng)5 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成完全培養(yǎng)液。

1.2.3免疫印跡分析提取細(xì)胞總蛋白后，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，TBST配制的脫脂奶粉封閉液封閉24 h，標(biāo)記鼠抗PAK4一抗(1∶1 000)室溫1.5 h，TBST清洗3次，標(biāo)記HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶1 000)，TBST清洗3次，ECL顯影。

1.2.4熒光定量分析以Trizol法提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR熒光染料定量檢測(cè)PAK4表達(dá)量。根據(jù)試劑說明書添加各組分后，95℃預(yù)變性30 s，然后40循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同時(shí)融解曲線分析。結(jié)果與內(nèi)參β-actin作比表示mRNA拷貝數(shù)。定量檢測(cè)引物序列：PAK4-F：5′-TCCCCCTGAGCCATTGTG-3′，PAK4-R:5′-TGACC-TGTCT CCCCA TCCA-3′；β-actin-F：5′-CCAACCGTGAAAAG-3′，β-actin-R：5′-GGCATACAGGGACA-3′。

1.2.5細(xì)胞增殖分析將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以0.5×104～1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。過夜培養(yǎng)后，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔100 μl。按轉(zhuǎn)染方法向細(xì)胞中加入脂質(zhì)體-待轉(zhuǎn)質(zhì)?；旌衔?，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，5 h后更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(MTT濃度為5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培養(yǎng)4 h后，移除培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，水平振蕩10 min，放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的光吸收值。代入下述公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光值-空白孔吸光值)/(對(duì)照組吸光值-空白孔吸光值)×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次后，將各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率導(dǎo)入SPSS軟件，計(jì)算P值。

1.2.6細(xì)胞周期分析將PBS清洗過的待測(cè)細(xì)胞收集到15 ml尖底離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液后用70%乙醇重懸細(xì)胞，4℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，移除固定液，加入PI染液，重懸細(xì)胞。室溫避光30 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2結(jié)果

2.1干擾PAK4表達(dá)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體24 h后，分別通過熒光定量和免疫印跡分析PAK4 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，PAK4 mRNA(圖1A)和蛋白質(zhì)(圖1B)表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)。干擾內(nèi)源PAK4表達(dá)后，三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖率分別下降(36.51±4.24)%(圖2A)和(38.54±5.43)%(圖2B)，均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2干擾PAK4表達(dá)對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞周期的影響轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體24 h后，對(duì)三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。PAK4干擾組G0/G1期細(xì)胞所占比例為(66.40±2.82)%和(72.01±3.13)%，與對(duì)照組(49.35±0.95)%和(51.89±0.96)%相比均顯著上升(圖3)，P<0.01，說明抑制PAK4表達(dá)可以將三陰乳腺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期。

2.3干擾PAK4表達(dá)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制有研究顯示PAK4通過激活MEK，進(jìn)而促進(jìn)ERK1/2的磷酸化。因此我們?cè)谌幦橄侔〣T549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PAK4干擾載體24 h后，檢測(cè)p-ERK1/2表達(dá)變化，與對(duì)照相比PAK4干擾組p-ERK1/2 表達(dá)顯著降低(圖4A)；進(jìn)一步，應(yīng)用MEK激酶MEK1和MEK2的高效選擇性抑制劑PD98059處理后，三陰乳腺癌BT549細(xì)胞的增殖率下降(46.41±7.16)%(圖4B)，與對(duì)照組差異顯著，P<0.01。

圖1　PAK4在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)量Fig.1　Expression of PAK4 in BT549 and MDA-MB-231 cell after PAK4 knockdownNote: mRNA(A)and protein(B)expression of PAK4 in BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with siRNA(si-PAK4)or control siRNA(NC),*.P<0.01.

圖2　干擾PAK4表達(dá)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖Fig.2　PAK4 knockdown suppressed proliferation of breast cancerNote: A.BT549 cells；B.MDA-MB-231 cells;*.P<0.01.

圖3　干擾PAK4表達(dá)對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞周期的影響Fig.3　Cell-cycle(G0/G1,S and G2/M)analysis of breast cancer after PAK4 knockdownNote: A.BT549 cells；B.MDA-MB-231 cells.*.P<0.01.

圖4　干擾PAK4表達(dá)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制Fig.4　Mechanism of inhibition effect of PAK4 knockd-own in TNBC cellsNote: A.Protein expression of p-ERK1/2 in BT549 cells transfected with siRNA(si-PAK4)or control siRNA(NC).B.PD98059 suppressed the proliferation of BT549 cells,*.P<0.05

3討論

乳腺癌發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位，并且其死亡率也增長(zhǎng)迅速，目前乳腺癌已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病[4]。隨著乳腺癌分子生物研究的深入，開發(fā)了針對(duì)不同分子分型的乳腺癌的分子靶向藥物，其臨床應(yīng)用大大提高了乳腺癌的治療效果。目前臨床以雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體2及Ki67將乳腺癌分成4種亞型，采用不同治療策略，取得了良好的治療效果。主要手段是針對(duì)雌激素受體、孕激素受體陽性采用內(nèi)分泌治療[5]；人表皮生長(zhǎng)因子受體2陽性，采用抗HER2的分子靶向治療[6]。然而，三者均為陰性的乳腺癌，內(nèi)分泌治療和分子靶向治療均無效，主要治療手段是化療，但其臨床特點(diǎn)為分級(jí)高、侵襲性強(qiáng)和進(jìn)展快，又缺乏有效治療手段，預(yù)后較差[3]。目前，三陰乳腺癌新治療靶點(diǎn)為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，如表皮生長(zhǎng)因子受體及趨化因子受體抑制劑的開發(fā)[7,8]，但仍存在較多問題，所以新型靶點(diǎn)的開發(fā)對(duì)三陰乳腺癌未來的治療策略具有重要意義。

p21蛋白激活激酶(PAK)為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，目前被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞信號(hào)調(diào)控網(wǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。PAK4是Ⅱ類PAK中最具有代表性的成員，其N末端不含自我抑制域(AID)[10]。PAK4在多數(shù)組織中具有表達(dá)，并且在多種腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)。在正常乳腺組織中低水平表達(dá)，在大多數(shù)乳腺癌中異常高表達(dá)，促進(jìn)了乳腺腫瘤惡性進(jìn)展，與腫瘤發(fā)生的多種標(biāo)志現(xiàn)象密切相關(guān)，如非停泊性生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移和侵襲等[11]。最新報(bào)道顯示PAK4高表達(dá)是乳腺腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，還是上皮來源乳腺癌去腺泡樣等上皮特征的原因，但是其在三陰乳腺癌中的作用機(jī)制尚不明確[12]。因此，本研究首先選擇了三陰乳腺細(xì)胞株MDA-MB-231和BT549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了PAK4的SiRNA干擾載體，抑制了細(xì)胞內(nèi)源的PAK4表達(dá)，通過熒光定量和免疫印跡分析PAK4 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著降低(圖1)。MTT分析發(fā)現(xiàn)，干擾內(nèi)源PAK4表達(dá)顯著抑制三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖(圖2)，說明PAK4在三陰乳腺癌細(xì)胞的增殖存活中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步，通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)PAK4被抑制表達(dá)后，三陰乳腺癌細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，細(xì)胞周期進(jìn)程停滯(圖3)。有研究顯示PAK4通過激活ERK通路發(fā)揮促增殖作用[13]。因此，利用免疫印跡檢測(cè)p-ERK1/2表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，干擾PAK4表達(dá)被抑制ERK通路的激活(圖4A)。但是，PAK4是否通過ERK通路在三陰乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮促增殖作用。我們進(jìn)一步利用ERK通路激活抑制劑PD98059處理三陰乳腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，增殖同樣受到抑制(圖4B)。這些結(jié)果說明PAK4通過激活ERK通路，在三陰乳腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制內(nèi)源PAK4表達(dá)，可以抑制三陰乳腺癌增殖，這也提示PAK4可能是三陰乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，針對(duì)PAK4表達(dá)的抑制劑可能具有抑制三陰乳腺癌的臨床價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]賴萬強(qiáng),曾健.三陰性乳腺癌的治療靶點(diǎn)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(19):3504-3506.

[2]王曉稼,Fox KR.受體三陰性乳腺癌的分子特征與治療研究進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展,2008,8(2):129-134.

[3]鐘輝鳳,陳曉品.三陰乳腺癌治療現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2015,31(4):488-490.

[4]鄭瑩,吳春曉,張敏璐.乳腺癌在中國(guó)的流行狀況和疾病特征[J].中國(guó)癌癥雜志,2013,23(8):561-569.

[5]單光蓮.乳腺癌與雌激素及有關(guān)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)治療研究[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師,2015,31(22):7-8.

[6]徐璐,曾雪,張志強(qiáng),等.乳腺癌分子靶向治療的現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)實(shí)用外科雜志,2015,35(7):790-793.

[7]Lee KH，Hsu EC，Guh JH，etal.Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase(AMPK)activator[J].J Biol Chem，2011，286(45):39247-39258.

[8]Stratford AL，Reipas K，Hu K，etal.Targeting p90 ribosomal S6 kinase eli minates tumor-initiating cells by inactivating Y-box binding protein-1 in triple-negative breast cancers[J].Stem Cells,2012,3(7):1338-1348.

[9]李冬霞,張慧,蔡松旺.p21活化激酶4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)病理生理雜志,2015,31(11):1956-1960.

[10]Cammarano MS,Nekrasova T,Noel B,etal.Pak4 induces premature senescence via a pathway requiring p16INK4/p19ARF and mitogen-activated protein kinase signaling[J].Mol Cell Biol,2005,25(21):9532-9542.

[11]Yeo D,He H,Baldwin GS.The role of p21-activated kinases in pancreatic cancer[J].Pancreas,2015,44(3):363-369.

[12]李彥姝,張紅艷,劉芙蓉,等.PAK4促進(jìn)人乳腺腫瘤細(xì)胞G_1/S期轉(zhuǎn)化機(jī)制探討[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(3):165-168.

[13]王子航,李春實(shí),康勁松,等.干擾PAK4表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌遷移侵襲的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2015,31(9):1183-1185.

[收稿2016-01-20修回2016-02-19]

(編輯許四平)

Effect of PAK4 on cell proliferation of TNBC cells

WANGZi-Hang,CHENLi-Yan,MIXu-Guang.

YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China

[Abstract]Objective:To analyze the mechanism of p21 Protein Activated Kinase 4(PAK4)on cell proliferation of triple negative breast cancer(TNBC)cells.Methods: The mRNA and protein expression of PAK4 was detected by qRT-PCR and western blot in TNBC cells transfected with siRNA PAK4;The proliferation of TNBC cells transfected with PAK4 Si were analysed by MTT assay;The related signaling pathways was detected by western blot in TNBC cells transfected with siRNA PAK4.Results: PAK4 knockdown could suppress the proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells.Comparing with normal control,the proliferation rate were down to(36.51±4.24)% and(38.54±5.43)%,the present of G0/G1 phase cells were uPto(66.40±2.82)% and(72.01±3.13)% and the expression of p-ERK1/2 was reduced.Treated with PD98059,ERK pathway inhibitor,the proliferation rate of BT549 cells were down to(46.41±7.16)%.Conclusion: PAK4 plays a key role in the proliferation of TNBC,and its promoting proliferation effect associated with activating ERK pathway.

[Key words]TNBC;p21 Protein Activated Kinase 4;Proliferation;ERK

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.007

作者簡(jiǎn)介：王子航(1994年-)，男，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級(jí)本科，主要從事抗腫瘤機(jī)制的研究，E-mail:1456825616@qq.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：陳麗艷(1974年-)，女，博士，教授，主要從事腫瘤分子病理學(xué)的研究，E-mail:lychen@ybu.edu.cn。

中圖分類號(hào)R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0636-04

①本文為吉林省科技廳青年基金項(xiàng)目(No. 20150520047JH)。

②延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，延吉133002。

③吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春130021。