吳　莉，趙　嫻，柯騰飛，陳澤谷，陸　林，魏韓笑,張承磊，劉　流△

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學影像科 650032；2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院整形外科 650032；3.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院放射科，?？?570208；4.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血管外科 650032)

自體內皮祖細胞促進組織工程骨血管化的體內外實驗研究

吳莉1，趙嫻2，柯騰飛1，陳澤谷3，陸林1，魏韓笑2,張承磊4，劉流2△

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學影像科 650032；2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院整形外科 650032；3.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院放射科，海口 570208；4.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血管外科 650032)

[摘要]目的探討自體內皮祖細胞(EPCs)在體內、外促進組織工程骨血管化的能力。方法將兔自體外周血EPCs及骨髓間充質干細胞(BMSCs)按聯(lián)合培養(yǎng)時細胞增殖率最大時配比(EPCs∶BMSCs=1∶2)體外培養(yǎng)(聯(lián)合培養(yǎng)組)，在體外采用實時定量PCR方法檢測成骨相關細胞因子Osteonectin、Osteopotin、Col-1及成血管相關細胞因子血管內皮生長因子(VEGF)表達，于培養(yǎng)3、7、14 d觀察表達量的變化并與單純EPCs及BMSCs組比較；將單純EPCs、BMSCs及聯(lián)合培養(yǎng)組的組織工程骨移植到兔四肢肌袋內，于移植后2、4、8周觀察組織工程骨生長情況，同時制成組織切片行CD34、CD105、ZO-1免疫組織化學染色，采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，測量光密度值，比較3組工程骨表達量變化。結果3、7、14 d Osteonectin、Osteopotin、Col-1、VEGF各組表達均逐漸增高，其中聯(lián)合培養(yǎng)組增高最明顯，且各時間點表達量最高(P<0.01)；2、4、8周兔四肢肌袋內的組織工程骨中聯(lián)合培養(yǎng)組細胞復合的工程骨隨時間延長成骨增加最明顯，新生血管長入最多，免疫組織化學顯示CD34、CD105、ZO-1表達最明顯(P<0.01)。 結論自體EPCs與BMSCs相互作用，在體內、體外均可促進組織工程骨血管化。

[關鍵詞]干細胞；內皮, 血管;間充質干細胞；新生血管化, 生理性；組織工程骨

近些年來組織工程技術研究在骨缺損修復中顯示出巨大的潛力，組織工程骨移植入體內，骨的血管化、成骨破骨細胞再生、骨端融合是移植骨成活的3個重要環(huán)節(jié)，其中血管化是前提，是組織工程骨內復合的干細胞存活、增殖、轉化為成骨組織替代支架的決定因素。目前組織工程骨的血管化不足、缺乏功能性血管已成為其發(fā)展進入臨床應用的最大障礙[1]。國內外學者采用多種方法加快組織工程骨內部血管網的形成使新生血管或血管網與宿主血管溝通，如改善或改造支架結構、成分，干細胞移植時加入血管生成因子及將內皮細胞與成骨細胞共同培養(yǎng)等方法[2]，但均不能生成保證細胞存活的足夠密度的微血管網。

表1　引物序列

研究報道，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)不僅可以促進新生血管生成，還可促進間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨[3]。因此本研究將自體來源的EPCs與骨髓MSCs(BMSCs)直接共培養(yǎng)形成共培養(yǎng)體系，體外與單純培養(yǎng)的EPCs與BMSCs兩組細胞比較成血管相關細胞因子血管內皮生長因子(vacular endothelial growth factor,VEGF)及成骨細胞因子(Osteonectin、Osteopotin、Col-1)的表達差異；將上述3組細胞復合到包被纖維粘連蛋白的部分脫蛋白生物骨(partially deproteinised bone，PDPB)上于兔四肢肌袋內培養(yǎng)，不同時間大體觀察及免疫組織化學檢測成骨及微血管化能力的差異，了解EPCs在BMSCs成骨中的促進作用。

1材料與方法

1.1實驗儀器5% CO237 ℃培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司，低溫離心機購自北京醫(yī)用離心機廠，RT-PCR儀購自Bio-Rad公司，倒置相差顯微鏡購自Olympus公司；L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司，胰蛋白酶、Trizol購自Takara公司，PDPB由本實驗組自制[4]，自體外周血EPCs及BMSCs由本實驗組自行分離培養(yǎng)鑒定后凍存，本次實驗為采用復蘇后第三代細胞，兔CD34、CD105、ZO-1一抗購自北京博奧森公司，逆轉錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司，引物設計由寶生物工程有限公司完成，Loading Buffer、DNA分子標記物購自 Fermantas公司。

1.2方法

1.2.1外周血EPCs促進BMSCs成骨細胞因子及成血管能力的體外檢測取本實驗組分離培養(yǎng)鑒定后[5]凍存的自體第3代EPCs及BMSCs復蘇后培養(yǎng)3 d，將單純EPCs(EPCs組)、BMSCs(BMSCs組)及共培養(yǎng)細胞(EPCs∶BMSCs=1∶2，聯(lián)合培養(yǎng)組)[5]3組細胞種植于9塊6孔板，每孔加1.5 mL含15% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換1次液。第3、7、14天分別取3塊板，Trizol法進行總RNA的提取，將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR反應，引物見表1，以上步驟按試劑盒說明書進行操作。用2-△△Ct計算Osteonectin、Osteopotin、Col-1、VEGF的相對表達量，以實驗組與對照組表達量差異倍數=實驗組2-△△Ct/對照組2-△△Ct表示。

1.2.2復合3組種子細胞的組織工程骨體內實驗取本實驗組凍存的自體第3代EPCs及BMSCs復蘇，將3組細胞復合在4 ℃冰箱儲存的包被纖維粘連蛋白大小為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的PDPB上：將PDPB置于裝有DMEM的培養(yǎng)皿中預濕后加入3組細胞，細胞濃度均為0.5×106/mL，總量為20 μL，培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h后置96孔板中，加完全培養(yǎng)基至總量為100 μL后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，第4天將復合3組細胞的組織工程骨異位移植到兔四肢肌袋內(移植兔即為復蘇的第3代EPCs及BMSCs的宿主，從而確保了自體移植)，分別于2、4、8周觀察工程骨與周圍軟組織的變化。各時間點每組取3塊工程骨制作成切片，每塊組織取中心部分連續(xù)切片3張，免疫組織化學染色CD34、CD105、ZO-1，每張切片隨機拍3個視野，用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，得到陽性細胞平均光密度值，比較各組工程骨內隨時間變化CD34、CD105、ZO-1表達量變化。

2結果

2.1體外3、7、14 d Osteonectin、Osteopotin、Col-1、VEGF表達變化采用實時熒光半定量分析，計算Osteopotin、Oteonectin、Col-1的表達量，此時以EPCs組為對照組，聯(lián)合培養(yǎng)組及BMSCs組為實驗組，結果顯示隨著時間延長Osteopotin、Osteonectin、Col-1 3個指標相對表達量逐漸增加，各時間點以聯(lián)合培養(yǎng)組增加最明顯，14 d為最高；計算VEGF時以BMSCs組為對照組，EPCs組及聯(lián)合培養(yǎng)組為實驗組，結果顯示VEGF隨時間延長，各時間點相對表達量值明顯增大，以聯(lián)合培養(yǎng)組最明顯，14 d為最高。見圖1。

A:Osteonectin ;B:Osteopotin ;C:Col-1 ;D:VEGF;用2-△△Ct計算相對表達量，以實驗組/對照組相對比值為計算倍數。

2.2第2、4、8周組織工程骨異位移植大體觀察及免疫組織化學染色檢測CD34、CD105、ZO-1表達情況

2.2.1第2、4、8周異位移植骨大體觀察情況第2周見肌袋邊緣軟組織包裹組織工程骨，與工程骨局部相連，但組織工程骨邊緣銳利，切面可見明顯工程骨孔隙；第4周包繞工程骨軟組織增多，工程骨表面變紅軟組織增厚，邊緣變鈍，部分切面孔隙內見鮮紅軟組織填充；第8周軟組織進一步包裹工程骨，與其分界不清，工程骨邊緣圓潤，切面大部分孔隙由鮮紅軟組織填充，以上現(xiàn)象聯(lián)合培養(yǎng)細胞組最明顯(圖2A～C)，其次為BMSCs組。

2.2.2第2、4、8周CD34、CD105、ZO-1表達情況隨著時間延長，組織內表達CD34、CD105、ZO-1的陽性細胞均增多，第2周EPCs及聯(lián)合培養(yǎng)細胞組見少量陽性細胞，BMSCs組未見陽性細胞；第4周逐漸圍成管腔形成新生血管，少量管腔內其內可見紅細胞；第8周，見明顯新生血管管腔且部分與宿主血管溝通。見圖2D～L。采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件測量陽性細胞光密度值，第2、4、8周3組間用單因素方差分析進行比較：F2周=5.537,P2周=0.008，F(xiàn)4周=24.167，P4周=0.000，F(xiàn)8周=6.541,P8周=0.004，均P<0.01，第2、4、8周各組間差異均有統(tǒng)計學意義，其中聯(lián)合培養(yǎng)組陽性細胞光密度值在各時間點最高，進一步兩兩比較見圖2M～O。

A～C:聯(lián)合培養(yǎng)細胞組生長大體觀察;D～F:聯(lián)合培養(yǎng)細胞組CD34(×200);G～I:聯(lián)合培養(yǎng)細胞組CD105(×200);J～L:聯(lián)合培養(yǎng)細胞組ZO-1(×200)；M～O：聯(lián)合培養(yǎng)細胞組第CD34、CD105、ZO-1表達分析圖;a：P<0.05，與EPCs組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合培養(yǎng)組比較；c：P<0.05，與BMSCs組比較。

圖22、4、8周組織工程骨異位移植聯(lián)合培養(yǎng)細胞組大體觀察及免疫組織化學CD34、CD105、ZO-1表達情況

3討論

組織工程骨重建是個復雜的過程，不僅涉及骨生成，還涉及血管生成。組織工程骨技術中種子細胞復合到可降解的生物載體上及時形成功能性血管才能保證種子細胞的存活[1]。在細胞和分子水平了解骨和血管生成機制及其相互關系和作用，有助于組織工程骨的存活及與宿主骨的整合，從而修復骨缺損[6]。BMSCs有高度自我更新及多向分化潛能，在體內、體外不同的微環(huán)境下均可誘導分化為成骨細胞、成軟骨細胞和破骨細胞，又由于其獨特的免疫調節(jié)作用，取材容易，不涉及倫理道德等特點，是組織工程應用最多的種子細胞[7]。但只使用一種細胞作為種子細胞誘導成骨有一定的局限性，很多時候復合在組織工程支架內的細胞即使同時移植了成骨所需因子，由于未形成與宿主的有效血液循環(huán)，沒有營養(yǎng)物質供應，在植入后很短時間就會死亡[2]，組織工程支架上的種子細胞只有在有氧代謝、細胞灌注充足，保證合理的營養(yǎng)物質供應和代謝產物的排出才能存活[8-9]。研究顯示移植復合一種種子細胞的支架結構后，周圍宿主血管內營養(yǎng)物質的擴散深度僅約150 μm/h[10]，尤其對于體積較大的工程骨，營養(yǎng)物質無法很快進入支架內部，從而使中心復合的干細胞壞死，無法成骨。研究者曾采用人臍靜脈內皮細胞、內皮細胞與間充質細胞聯(lián)合移植促進組織工程骨的血管化，但由于上述兩種細胞分化能力較差，會出現(xiàn)明顯的移植后凋亡，因此并未被廣泛應用。EPCs是內皮細胞的前體細胞，與造血干細胞表達相同表面標志物，存在于臍帶血、骨髓及外周血中，骨髓是其最主要的來源，在前炎癥因子等的刺激下，可遷移到外周血及組織中，分泌VEGF，其與EPCs上的VEGF受體特異性結合，活化受體細胞內段偶聯(lián)的絡氨酸激酶，催化下游的信號蛋白從而促使EPCs增殖并定向向內皮細胞分化[11]，促進新生血管管腔形成，在新生血管生成中起重要作用[12]。有研究將VEGF165基因通過腺病毒載體轉染至內皮祖細胞，不僅提高了內皮祖細胞分泌VEGF效率，同時也提高了EPCs自身增殖能力[13]，從而表明VEGF是EPCs促進血管生成中最重要的因子。有研究證明[14]粒細胞集落刺激因子(G-CSF)可動員外周血EPCs細胞，提高VEGF和基質細胞衍生因子1(SDF-1)的表達，增強EPCs增殖能力和歸巢能力。

BMSCs通過旁分泌分泌多種可溶性細胞因子如VEGF、G-CSF、骨形成蛋白-2(bone morphogeneticp roteins-2,BMP-2)等參與EPCs促進新生血管管腔形成過程，VEGF及G-CSF可被EPCs利用，進一步促進EPCs新生血管及形成血管管腔[15]。有研究報道顯示[16]BMSCs與EPCs通過直接接觸和旁分泌信號表達相互作用，促進血管和骨的形成：直接接觸改變共培養(yǎng)環(huán)境，上調黏附蛋白、生長因子等細胞因子的分泌，其中BMP-2與VEGF間的相互作用起著很重要的作用[17]。本實驗將自體EPCs及BMSCs按照最佳比例(1∶2)共同培養(yǎng)形成聯(lián)合培養(yǎng)體系并復合在組織工程支架上，體外培養(yǎng)3、7、14 d檢測顯示，聯(lián)合培養(yǎng)細胞組成骨相關因子Osteopotin、Osteonectin、Col-1表達量較BMSCs組及EPCs組明顯增加(P<0.01)，14 d最高，可見將兩種細胞聯(lián)合培養(yǎng)促進了骨及新生血管的生成。另有報道顯示BMSCs可在低氧環(huán)境中釋放多種血管生成因子及抑制BMSCs細胞向脂肪細胞及成骨、破骨細胞轉化，在這里起主要作用的調節(jié)因子是作為轉錄因子的低氧誘導因子(hypoxia-inducing factor 1,HIF-1)，它可以通過活化內皮生長因子調節(jié)血管形成。在低氧條件下，HIF-1的α亞型呈指數上調，刺激了多種血管形成蛋白如VEGF等級聯(lián)式地增加，從而促進組織工程骨內新生血管的形成[18-19]。BMP-2既可由BMSCs分泌，其亦是EPCs分泌的重要生長因子[20]，在移植后15 min內即可促進BMSCs成骨分化[21-23]，將EPCs與BMSCs采用Transwell小室間接共培養(yǎng)，可明顯提高BMSCs的干性功能、增殖和分化能力及成骨能力，溫麗[24]認為是EPCs旁分泌的細胞因子所起的作用，即在EPCs旁分泌因子的作用下，BMSCs增加了VEGF及BMP-2等的分泌，從而促進了新生血管的形成及成骨。

本實驗將聯(lián)合3組種子細胞的組織工程骨移植至兔四肢肌袋內使其生長分化，觀察其變化，培養(yǎng)2個月后，聯(lián)合培養(yǎng)細胞體系復合的組織工程支架未出現(xiàn)排異反應，且逐步降解，由膠原、骨小梁及新生骨替代，且其內見大量表達CD34、CD105、ZO-1的血管內皮細胞、部分形成血管腔結構且與周圍軟組織內血管溝通，代表組織工程骨移植成功且血管化良好，認為EPCs可加快組織工程骨內新生血管及血管網的形成，增加BMSCs的存活數量，提高其增殖和成骨轉化能力。CD34是特異性的血管內皮細胞標記物，能突出顯示較小的不成熟的微血管和單個內皮細胞，然而成熟的血管內皮細胞CD34也可表現(xiàn)為陽性；本研究還采用新生血管特異性標記CD105，其是研究腫瘤、組織工程移植物及血管病變治療后探討新生血管生長能力的重要指標。ZO-1是緊密連接蛋白，其表達代表血管為功能性血管，可見流動血流通過，ZO-1與CD105陽性說明新生血管為功能性血管，具有攜帶營養(yǎng)物質帶走代謝產物的功能[25]。

本實驗將兩種細胞共同培養(yǎng)形成聯(lián)合培養(yǎng)體系，無論在體內、體外均增加了成骨和成血管因子的表達水平，說明EPCs不僅促進組織工程骨血管化的形成，還促進BMSCs成骨，認為這是在兩種細胞直接或間接相互作用基礎上形成的，盡管本研究顯示了這一結果，但兩細胞相互作用的確切分子機制還沒有完全明確，有待于進一步研究。本次實驗結果為自體細胞復合的組織工程骨應用于臨床提供了理論基礎。

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Autologous endothelial progenitor cells promote the neovascularization of tissue engineering bone in vitro and vivo*

WuLi1,ZhaoXian2,KeTengfei1,ChenZegu3,LuLin1,WeiHanxiao2,ZhangChenglei4,LiuLiu2△

(1.DepartmentofMedicalImaging,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China;2.DepartmentofPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China;3.DepartmentofRadiology,theAffiliatedHaikouHospitalofXiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Haikou570208,China;4.DepartmentofVascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)

[Abstract]ObjectiveInvestigate the ability of autologous endothelial progenitor cells (EPCs) in promoting the neovascularization of tissue engineering bone in vitro and vivo.MethodsCo-culture EPCs drived from autologous peripheral blood and mesenchymal stem cells drived from bone marrow (BMSCs) at the best proportion of 1∶2 which was the largest cell proliferation rate in vitro,osteogenesis related cytokines Osteonectin,Osteopotin,Collagen Type 1(Col-1) and angiogenesis related cytokine VEGF in vitro by using real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR),and compared with pure EPCs and BMSCs groups at 3rd,7th and 14th day;the tissue engineering bone seeded with EPCs,BMSCs and co-culture cells (EPCs∶BMSCs=1∶2) were transplanted into rabbit limbs muscle,the growing states of tissue engineering bone were observed at 2,4 and 8 weeks after transplantation,at the same time the expression of CD34,CD105 and ZO-1 were detected with immunohistochemistry staining.ResultsThe mRNA expression of Osteonectin,Osteopotin,Col-1 and VEGF were gradually increased when detected at 3rd,7th and 14th day with real-time PCR,and the co-culture cells group increased most obviously in the three groups in vitro at the same period time(P<0.01)；The microvascularization of the engineering biological bone were observed in vivo with immunohistochemistry，and neovascularization of co-culture cells group was also the most obvious group in three groups,immunohistochemical showed that CD34,CD105 and ZO-1 was also higher than the other two groups(P<0.01).ConclusionAutologous EPCs interact with BMSCs could promote vascularization of tissue engineering bone both in vivo and in vitro.

[Key words]stem cells;endothelium,vascular;bone marrow mesenchymal stem cells;neovascularization, physiologic;tissue engineered bone

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.005

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81460298)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學應用基礎研究聯(lián)合專項(2015 FB 038)。

作者簡介：吳莉(1976-)，主治醫(yī)師，在讀博士，主要從事組織工程與分子影像學方面研究。 △通訊作者：E-mail:liuliu3939@126.com。

[中圖分類號]R318.08

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)02-0159-05

(收稿日期：2015-09-10修回日期：2015-10-10)