代佑果,李為明,唐輝蓉,石安華,甘　平,寸英麗,劉　琴,關(guān)瓊瑤,崔　進(jìn)△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院腹部外科　650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部醫(yī)科外科　650101；3.云南中醫(yī)學(xué)院病理教研室，昆明 650500)

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論著·基礎(chǔ)研究

生理性深層海水對(duì)小鼠高溫耐受力的影響*

代佑果1,李為明2,唐輝蓉2,石安華3,甘平1,寸英麗1,劉琴1,關(guān)瓊瑤1,崔進(jìn)2△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院腹部外科650118；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部醫(yī)科外科650101；3.云南中醫(yī)學(xué)院病理教研室，昆明 650500)

[摘要]目的探討生理性深層海水(PDSW)對(duì)45.0 ℃高溫環(huán)境動(dòng)物耐受性的影響及機(jī)制。方法將取自我國(guó)海南省海域的深層海水進(jìn)行制備，制成PDSW，檢測(cè)所含有的部分元素。20只昆明小鼠，雌雄各半，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組小鼠飲用自來(lái)水，實(shí)驗(yàn)組飲用PDSW，連續(xù)15 d，然后把各組小鼠放入45.0 ℃高溫環(huán)境下飼養(yǎng)，記錄每只小鼠死亡時(shí)間，直至各組小鼠全部死亡為止。并取每只小鼠腦、肺、心、肝和腎做病理檢查。結(jié)果無(wú)論是雌性小鼠還是雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)組的小鼠在45.0 ℃高溫下的生存時(shí)間比對(duì)照組的小鼠長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且雌性小鼠的生存時(shí)間要比雄性小鼠的生存時(shí)間長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)分析表明PDSW對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的腦、心、肺、肝、腎等器官均有保護(hù)作用。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織HSP72表達(dá)較對(duì)照組強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)DSW可以增強(qiáng)小鼠對(duì)45.0 ℃高溫環(huán)境的耐受性，其機(jī)制考慮與PDSW促進(jìn)熱休克蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]生理性深層海水；高溫,誘發(fā)；耐受力

一般來(lái)說(shuō)，海平面以下超過(guò)200 m深海中的海水即被稱為深層海水。深層海水占海水總量的約93%，儲(chǔ)量豐富。大量研究表明，海洋深層水潔凈，無(wú)菌，富含礦物質(zhì)和微量元素，且所含礦物質(zhì)和微量元素幾乎達(dá)到均衡狀態(tài)，從而使其有別于表層海水[1]。由于深層海水具有的特質(zhì)，其在海水養(yǎng)殖業(yè)、食品業(yè)受到歡迎。目前，深層海水在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有了用武之地，已成為一種奇妙的“綠色藥品”。

腫瘤熱療作為定向能量外科技術(shù)中的一個(gè)重要組成部分，其在腫瘤治療中的作用日漸突出[2]。如何減輕熱療的不良反應(yīng)以及提高機(jī)體的耐受力成為腫瘤熱療研究的熱點(diǎn)。本研究給予實(shí)驗(yàn)小鼠飲用制備的生理性深層海水(physiological deep-sea water,PDSW)，并對(duì)其在45.0 ℃高溫環(huán)境下的耐受力做了初步研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總共20只昆明種小白鼠，6～8周齡，雌雄各半，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2深層海水采集、制備及部分元素檢測(cè)在我國(guó)南海海域獲取海平面200 m以下的深層海水，避光運(yùn)至昆明，室溫避光儲(chǔ)存，在0.3 MPa壓力下，經(jīng)5、1 μm聚丙烯熔噴PP棉超微過(guò)濾后，用KDF(銅鋅合金) 除去海水中的重金屬，反復(fù)凍融方法濃縮并去除海水中多余的鹽分濃縮海水，0.01 μm PVC合金超濾膜除細(xì)菌、部分病毒和微小雜質(zhì)，活性炭吸附異味，制備成PDSW。電感耦合等離子體質(zhì)鐠(ICP-MS)多次檢測(cè)PDSW中部分元素的含量(表1、2)，并用昆明地區(qū)自來(lái)水所含相應(yīng)元素做對(duì)照。深層海水的硬度以如下公式計(jì)算[3]:硬度= Mg(mg/L) ×4.1 + Ca(mg/L) ×2.5。本實(shí)驗(yàn)用PDSW硬度為3 000 ppm。

表1　　PDSW與自來(lái)水中7種宏量元素檢測(cè)

a:農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明)檢測(cè)結(jié)果。

表2　　PDSW與自來(lái)水中16種微量元素檢測(cè)

a:檢出限(mg/L) V 0.000 2，As 0.001 0，Hg 0.000 2;b:農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明)檢測(cè)結(jié)果。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組同窩生昆明種小鼠分為兩組，每組5只(其余小鼠最后未納入實(shí)驗(yàn))，實(shí)驗(yàn)組飲用PDSW，對(duì)照組飲用自來(lái)水。小鼠可自由飲水和采食，喂養(yǎng)15 d。

1.2.245.0 ℃高溫環(huán)境下小鼠的生存分析給實(shí)驗(yàn)小白鼠口服PDSW 15 d后，把各組動(dòng)物放入45.0 ℃高溫環(huán)境下飼養(yǎng)，記錄每只小鼠死亡時(shí)間，直至實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組全部死亡為止。繪制各組生存時(shí)間曲線，計(jì)算各組平均生存時(shí)間。

1.2.3病理學(xué)檢測(cè)分析對(duì)所有死亡雄性動(dòng)物的腦、心、肺、肝和腎等進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)檢查，石蠟切片，HE染色；觀察各臟器的損壞程度和病變特點(diǎn)。

1.2.4雄性小鼠肝組織熱休克蛋白(HSP72)表達(dá)測(cè)定采用Western blot檢測(cè)各組肝組織HSP72表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.1飲用PDSW的昆明小鼠對(duì)45.0 ℃高溫的耐受性影響無(wú)論是雌性小鼠還是雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠在45.0 ℃高溫下的生存時(shí)間比對(duì)照組的小鼠長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且雌性小鼠的生存時(shí)間要比雄性小鼠的生存時(shí)間長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在45.0 ℃高溫環(huán)境下的

圖1　　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在45.0 ℃高溫環(huán)境下的

2.245.0 ℃高溫對(duì)實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠各重要器官的組織學(xué)的影響組織學(xué)分析表明PDSW對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的腦、心、肺、肝、腎等器官均有保護(hù)作用，放大倍數(shù)為×400，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，PDSW組腦、心、肺、肝、腎均無(wú)明顯異常；而對(duì)照組腦組織可見(jiàn)神經(jīng)元喪失及膠樣變性，間質(zhì)疏松，充血、水腫；心肌組織可見(jiàn)心肌出血，心肌細(xì)胞局灶溶解，部分脂肪變性；肺組織可見(jiàn)肺泡壁毛細(xì)血管充血，肺泡腔無(wú)滲出物；肝組織可見(jiàn)部分肝細(xì)胞漿中空泡，肝竇充血；腎臟組織可見(jiàn)腎小管壞死、水腫，血管球及間質(zhì)充血和出血。見(jiàn)圖2。

2.345.0 ℃高溫對(duì)實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠肝組織HSP72 表達(dá)的影響飲用PDSW小鼠在經(jīng)歷45.0 ℃高溫后，肝組織HSP72表達(dá)明顯比對(duì)照水組增強(qiáng)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。見(jiàn)圖3。

圖2　　各組小鼠經(jīng)歷45.0 ℃高溫后各重要器官的組織學(xué)表現(xiàn)(×100)

圖3　　　經(jīng)歷45.0 ℃高溫后各組小鼠肝組織

3討論

全身熱療是指通過(guò)使用各種方式設(shè)法使體溫升高并維持在39.5～41.5 ℃數(shù)小時(shí)的一種熱療方法，它作為腫瘤出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移時(shí)的一種治療被使用，正越來(lái)越受到腫瘤治療學(xué)家的關(guān)注[3]。

正因?yàn)槿頍岑熤委熌[瘤的作用顯著，目前已成功應(yīng)用于中晚期胃癌[4]、胰腺癌[5]、卵巢癌[6]和黑色素瘤[7]等的治療，取得了令人鼓舞的結(jié)果。當(dāng)然，全身熱療在發(fā)揮治療作用同時(shí)也存在一些不足之處[8]。(1)全身性生理變化：全身加熱可使體溫達(dá)到41.0～43.0 ℃，對(duì)機(jī)體將造成一定的影響。由于全身加溫皮膚血液流量、血液容積的增加，可引起高血壓、心律加快、心率不齊等循環(huán)系統(tǒng)的改變?？赡馨l(fā)生的并發(fā)癥包括肺水腫、呼吸性酸中毒、消化道反應(yīng)(惡心、嘔吐、腹瀉)以及熱療后短時(shí)間高熱。(2)需要全身麻醉：由于人體皮膚對(duì)加熱的耐受性難以達(dá)到在清醒狀態(tài)下接受治療的可能，因此需要在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行全身熱療，由此引發(fā)較高的皮膚燙傷率，對(duì)患者的管理造成不便。這些問(wèn)題的存在，制約了全身熱療的推廣應(yīng)用。目前認(rèn)為亞高溫?zé)岑熆梢栽黾泳植垦骱徒档湍[瘤乏氧程度，而且不良反應(yīng)輕。而要使亞高溫?zé)岑?39.5～41.5 ℃)達(dá)到高溫?zé)岑?41.5～43.0 ℃)同樣的效果，就必須延長(zhǎng)治療的時(shí)間達(dá)3～6 min。時(shí)間延長(zhǎng)以及高溫對(duì)患者的耐受均是一個(gè)考驗(yàn)。

與表層海水比較，深層海水具有以下特點(diǎn)：低溫、潔凈性、富含平衡易吸收的微量元素、氧化還原水、pH 值呈弱堿性[9]。飲用深層海水可糾正元素異常，恢復(fù)患者的Ca/Mg比例及Al、Hg和Pb水平[10]。長(zhǎng)期飲用深層海水可促進(jìn)機(jī)體的元素平衡，例如其中的Na和K均衡有助于維持機(jī)體的酸堿平衡[11]；Ca和Mg比例的適當(dāng)對(duì)調(diào)節(jié)脂代謝及維持心血管系統(tǒng)的正常功能尤為重要[12-13]。內(nèi)皮細(xì)胞中的微量元素Cu、Zu和Mn，通過(guò)Cu/Zn-超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和錳-SOD形式，可發(fā)揮清除氧自由基的重要生理功能[14]。飲用深層海水可以增加機(jī)體Se水平，Se也是機(jī)體內(nèi)一種強(qiáng)大的自由基清除劑[11]。Se、Cu、Zn和Mn這些元素在機(jī)體的損傷修復(fù)，以及提高機(jī)體的耐受力中具有重要意義?，F(xiàn)代研究表明飲用富含礦物質(zhì)的深層海水能加速30 ℃下訓(xùn)練后疲勞恢復(fù)[15]。本研究組李為明等[16]的研究表明深層海水能改善酶的功能，減少小鼠的耗氧量，能明顯增強(qiáng)小鼠的耐受力。此外，深層海水可顯著提高小鼠胸腺、脾指數(shù)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，提高外周血CD4+細(xì)胞百分含量及CD4+/CD8+細(xì)胞比例，增加血清IgA、IgM水平。因而，深層海水可增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能[17]。在小鼠創(chuàng)傷模型中，給予小鼠深層海水，可以促進(jìn)小鼠創(chuàng)面的愈合[18]。

本研究使用PDSW喂養(yǎng)KM小鼠15 d，然后在45.0 ℃高溫環(huán)境下飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是雌性小鼠還是雄性小鼠，飲用PDSW組的昆明小鼠在45.0 ℃高溫下的生存時(shí)間比飲用自來(lái)水組的小鼠長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且雌性小鼠的生存時(shí)間要比雄性小鼠的生存時(shí)間長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)分析表明PDSW對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的腦、心、肺、肝、腎等器官均有保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，PDSW能夠提高實(shí)驗(yàn)昆明小鼠對(duì)高溫的耐受性。

文獻(xiàn)報(bào)道，HSP72可通過(guò):(1)分子伴侶作用;(2)抑制細(xì)胞凋亡;(3)減輕氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷;(4)防止Ca超載,抑制NF-κB的活化和TNF-α的產(chǎn)生,使再灌注后肝酶釋放顯著減少,從而保護(hù)肝細(xì)胞線粒體的完整性,防止細(xì)胞凋亡,從而減輕肝臟實(shí)質(zhì)的缺血再灌注損傷[19]。而高溫可激活熱休克因子1(heat shock factor 1,HSF1),促進(jìn)HSP基因的轉(zhuǎn)錄,使其高度表達(dá),通過(guò)HSP起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠在經(jīng)歷45.0 ℃高溫后，肝組織HSP72表達(dá)明顯比對(duì)照組小鼠增強(qiáng)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此推測(cè)，飲用PDSW的昆明小鼠對(duì)45.0 ℃高溫的耐受增強(qiáng)是HSP72表達(dá)增加的結(jié)果，進(jìn)一步的機(jī)制需要更多的研究來(lái)闡明。

參考文獻(xiàn)

[1]Tsuchiya Y,Watanabe A,Fujisawa N,et al.Effects of desalted deep seawater on hematologic and blood chemical values in mice[J].Tohoku J Exp Med,2004,203(3):175-182.

[2]劉珈.腫瘤熱療技術(shù)與臨床實(shí)踐[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2009:243-250.

[3]Hwang HS,Kim HA,Lee SH,et al.Anti-obesity and antidiabetic effects of deep sea water on ob/ob mice[J].Mar Biotechnol,2009,11(4):531-539.

[4]Zhao C,Dai C,Chen X.Whole-body hyperthermia combined with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of stage Ⅳ advanced gastric cancer[J].Int J Hyperthermia,2012,28(8):735-741.

[5]Bakshandeh-Bath A,Stoltz AS,Homann N,et al.Preclinical and clinical aspects of carboplatin and gemcitabine combined with whole-bodyhyperthermia for pancreatic adenocarcinoma[J].Anticancer Res,2009,29(8):3069-3077.

[6]Atmaca A,Al-Batran SE,Neumann A,et al.Whole-bodyhyperthermia (WBH) in combination with carboplatin in patients with recurrent ovarian cancer-a phase Ⅱ study[J].Gynecol Oncol,2009,112(2):384-388.

[7]Jia D,Rao W,Wang C,Jin C,et al.Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia[J].Int J Hyperthermia,2011,27(3):275-285.

[8]唐勁天，洛小林，朱京麗.全身加溫治療的現(xiàn)狀與展望[J].中華放射腫瘤學(xué)雜,2000,9(2):140-143.

[9]Tsuchiya Y,Nakamura K,Sekikawa H,et al.Subacute effects of deep-sea water from the Japan Sea on blood examination values in mice[J].Environ Health Prev Med,2002,7(5):189-192.

[10]Kimata H,Tai H,Nakagawa K,et al.Improvement of skin symptoms and mineral imbalance by drinking deep sea water in patients with atopic eczema/derma-titis syndrome (AEDS)[J].Acta Medica (Hradec Kralove),2002,45(2):83-84.

[11]Hataguchi Y,Tai H,Nakajima H,et al.Drinking deep-sea water restores mineral imbalance in atopic eczema/dermatitis syndrome[J].Euro J Clin Nutrit,2005,59(9):1093-1096.

[12]Yoshioka S,Hamada A,Cui T,et al.Pharmacological activity of deep-sea water:examination of hyperlipemia prevention and medical treatment effect[J].Biol Pharm Bull,2004,27(11):1784-1787.

[13]Chi CW.Dietary deep seawater and hepatic steatosis[J].J Chin Med Assoc,2013，76(3):121-122.

[14]Katsuda S,Yasukawa T,Nakagawa K,et al.Deep-sea water improves cardiovascular hemodynamics in Kurosawa and Kusanagi-hypercholesterolemic(KHC) rabbits[J].Biol Pharm Bull,2008,31(1):38-44.

[15]Hou CW,Tsai YS,Jean WH,et al.Deep ocean mineral water accelerates recovery from physical fatigue[J].J Int Soc Sports Nutr,2013,10(1):1-7.

[16]李為明，崔進(jìn)，徐鵬遠(yuǎn),等.“深層海水”對(duì)小鼠耐受力的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013,25(7):826-829.

[17]李為明，崔進(jìn)，徐鵬遠(yuǎn),等.“深層海水”對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013,25(7):903-906.

[18]李為明,崔進(jìn),徐鵬遠(yuǎn),等.深層海水對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014,43(4):462-464.

[19]Mokuno Y,Berthiaume F,Tanimura Y,et al.Heat shock preconditioning inhibits CD4+T lymphocyte activation in transplanted fatty rat livers[J].J Surg Res,2006,135:92-99.

Effect of physiological deep-sea water on the hyperthermal tolerance of mice*

DaiYouguo1,LiWeiming2,TangHuirong2,ShiAnhua3,GanPing1,CunYingli1,LiuQin1,GuanQiongyao1,CuiJin2△

(1.DepartmentofAbodominal,theThirdAffilliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity/TumorHospitalofYunanProvince,Kunming,Yunnan650118,China;2.DepartmentofCardresMedicaltheSecondAffilliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650101,China;3.PathologicalTeachingandResearchOfficeYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650101,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of physiological deep-sea water(PDSW) on hyperthermal tolerance of Kunming(KM) mice in the 45.0 ℃ environment.MethodsDeep-sea water from the south Chinese sea was processed,and the metallic elements dissolved in the DSW were analysed.The mice were randomly divided into 2 groups:the control group received tap water;the experimental group treated with PDSW for 15 d.And then the mice were fed in the 45.0 ℃ conditions.The survival time and histomorphometric analyses of the brain,lung,heart,liver and kidney were investigated.ResultsThe survival time in PDSW-fed group was significantly longer than that of the control group (P<0.05).Moreover,histomorphometric analyses showed that PDSW could protect the brain,lung,heart,liver and kidney of KM mice from the 45.0 ℃ conditions.The results of western blot revealed that expression of HSP72 of liver tissues for PDSW-fed group substantially increased,when compared with the control mice(P<0.05).ConclusionPDSW could improve hyperthermal tolerance of KM mice,which maybe in the relation with expression of HSP72 promoted by PDSW.

[Key words]physiological deep-sea water;hyperthermia,induced;tolerance

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.012

基金項(xiàng)目：云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2010CD166)。

作者簡(jiǎn)介：代佑果(1978-)，副教授，博士，主要從事肝細(xì)胞癌臨床及基礎(chǔ)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:yncuijin@126.com。

[中圖分類號(hào)]R282.77

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0033-04

(收稿日期：2015-06-14修回日期：2015-09-19)