賴　平，陳懿建，羅耀玲，張敏鴻，楊建瓊，邱悅?cè)?/p>

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2014級研究生；2.第一附屬醫(yī)院 a.血液科；b.臨床科研中心，江西　贛州　341000)

?

人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定*

賴平1，陳懿建2a，羅耀玲2b，張敏鴻2b，楊建瓊2b，邱悅?cè)?

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2014級研究生；2.第一附屬醫(yī)院 a.血液科；b.臨床科研中心，江西贛州341000)

摘要:目的:探討機械剪碎組織加酶液消化法分離、培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性，并對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法:取足月產(chǎn)人胎盤，采用機械剪碎組織加酶液消化法分離，密度梯度離心法提純胎盤組織中的細(xì)胞，利用細(xì)胞生長特性對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化并傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記。結(jié)果:在倒置顯微鏡下，細(xì)胞為貼壁生長，形態(tài)呈長梭形，少數(shù)為多角形，胎盤組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可穩(wěn)定長期傳代培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD73、CD90、CD105 表達(dá)陽性， CD34、CD45、HLA-DR 表達(dá)陰性。結(jié)論:聯(lián)合利用機械剪碎胎盤組織和酶消化法可高效獲取胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，獲取的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中生長穩(wěn)定，增殖能力強，可長期傳代或凍存。

關(guān)鍵詞：人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；機械剪碎；酶消化；干細(xì)胞培養(yǎng)

間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的條件下可以被誘導(dǎo)分化為多種類型的組織細(xì)胞，一直被認(rèn)為是極佳的進(jìn)行科學(xué)研究和醫(yī)用資源[1]。干細(xì)胞可通過骨髓、脂肪組織、臍帶血等途徑獲取。以往的獲取途徑因受到道德及倫理的限制不能廣泛開展。雖來源廣泛，不同來源的干細(xì)胞獲取、分離、純化困難也大大限制了其應(yīng)用。胎盤中有大量的滋養(yǎng)細(xì)胞及豐富的胚外中胚層的間充質(zhì)和血管[2]，從中獲取的干細(xì)胞可以很好的解決干細(xì)胞缺乏的現(xiàn)狀。胎盤是醫(yī)療廢物，分娩結(jié)束后對胎兒及產(chǎn)婦無影響，不受道德約束，并且含有豐富的干細(xì)胞。本研究擬采用機械剪碎組織加酶液消化法從胎盤絨毛層獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，并且用淋巴細(xì)胞分離液及間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性進(jìn)一步純化細(xì)胞，從而進(jìn)一步觀察其生物學(xué)特性，與以往獲取方法相比具有簡單、高效、獲取細(xì)胞數(shù)量多等特點，為以后的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料及方法

1.1主要材料及儀器足月順產(chǎn)胎兒胎盤來自贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，遵守相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定并經(jīng)家屬同意獲得,母血經(jīng)傳染病檢測均為陰性。淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll),Ⅱ型膠原酶，低糖DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司，型號Forma 311)，倒置顯微鏡(Olympus 公司，型號 CKX 41)，超凈工作臺(上海博迅公司，型號 SW-CJ-2FD),低速離心機(江蘇環(huán)宇公司，型號80-2型)，高精度恒溫水浴箱(上海博迅公司，型號 SSW-600-2S)。

1.2胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)細(xì)胞分離純化于不同的時間段重復(fù)三次，由相同的實驗人員在超凈臺中進(jìn)行，具體操作如下：取保持無菌狀態(tài)的新鮮足月順產(chǎn)胎兒胎盤一個，胎兒面朝向手心，母體面朝上，減去上層厚約2～3 mm的母體面。獲取深部呈網(wǎng)狀的胎盤組織約50 g置于無菌的培養(yǎng)皿中[3],用生理鹽水反復(fù)沖洗至無血跡，用已消毒處理的剪刀將組織盡可能剪碎，呈肉糜狀(以能用吸管吸取為標(biāo)準(zhǔn))，轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，按體積比約1∶6加入Ⅱ型膠原酶(0.1%)[4]，置于37 ℃恒溫水浴箱中消化30 min,間隔5 min適當(dāng)混勻組織與消化液。多層紗布過濾取濾液，置于離心管中， 1 000 r·min-1，常溫下離心5 min，棄上清，用PBS約5 mL重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液緩慢加至已配好的淋巴細(xì)胞分離液中。1 500 r·min-1,4 ℃離心20 min，離心后可見“白膜層”[5]，小心吸取該區(qū)域細(xì)胞，并加入4倍于該體積的PBS稀釋，1 000 r·min-1，常溫下離心5 min。重復(fù)一次，棄上清，用6 mL完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清的低糖DMEM)充分混懸細(xì)胞，平均接種于細(xì)胞3個培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后首次換液，去除未能貼壁的細(xì)胞，之后每3～4天換液一次[6]。待細(xì)胞生長達(dá)80%～90%融合度時可用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)或凍存。在重復(fù)實驗中均能獲取大量的細(xì)胞，倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量有一定差別，經(jīng)培養(yǎng)后的細(xì)胞在細(xì)胞活性，傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞性狀經(jīng)倒置顯微鏡觀察無明顯差異。

1.3細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定在三次培養(yǎng)的細(xì)胞中分別取第3代生長良好的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基，用PBS洗一遍后加入胰酶消化3 min，加入雙倍的完全培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，再用PBS洗滌離心處理兩次后，經(jīng)細(xì)胞篩過濾后，加入PBS制成約1×106個·mL-1的細(xì)胞懸液，加入CD105,HLA-DR, CD34相關(guān)抗體后避光保存至少15 min后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性檢測指標(biāo)是不表達(dá)造血干細(xì)胞的CD34和HLA-DR,而CD105持續(xù)陽性[7-9]。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞觀察實驗重復(fù)三次的結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，于倒置顯微鏡下均可見經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后獲取的細(xì)胞以圓形為主，可見部分紅細(xì)胞或小組織塊(如圖1A所示)；接種于培養(yǎng)12 h左右細(xì)胞出現(xiàn)貼壁生長，呈梭形；72 h后細(xì)胞貼壁牢固，長梭形(如圖1B所示)；7天后可見細(xì)胞數(shù)量較多，呈貼壁生長，長梭形，類似成纖維細(xì)胞，與大部分干細(xì)胞形態(tài)相似，有的胞漿突起，少數(shù)呈多角形(如圖1C所示)；傳代后的細(xì)胞生長速度較快，鏡下觀察形態(tài)均一，少數(shù)呈多形性，呈平行排列或漩渦狀生長(如圖1D所示)。

A:剛接種至培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，細(xì)胞未貼壁，呈圓形×10；

B:培養(yǎng)72 h后的P1代細(xì)胞呈貼壁生長,長梭型×10；C:培養(yǎng)7天后的P1代細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量較多，部分生長較快×10；

D:經(jīng)傳代后的P3代細(xì)胞培養(yǎng)7天后生長密集，平行排列或呈漩渦狀×10。

圖1胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞獲取及培養(yǎng)不同時期的形態(tài)學(xué)變化

2.2細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定分別取適量三次重復(fù)實驗的P3代細(xì)胞，經(jīng)流式檢測結(jié)果示均為表達(dá)CD105(>80%),不表達(dá)HLA-DR(<1%), CD34(<1%),CD45(<2%)，符合胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記情況[7-9]，三次檢測結(jié)果在陽性細(xì)胞比例上有一定差異，證實了經(jīng)上述方法獲取的細(xì)胞是胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，鑒定結(jié)果如下(圖2、3)。

CD105，CD34，HLA-DR表達(dá)均為陰性。

圖2未染色胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果

CD105表達(dá)陽性，CD34，HLA-DR表達(dá)均為陰性。

圖3經(jīng)染色處理的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞檢測結(jié)果

3討論

間充質(zhì)干細(xì)胞自首次分離出來就引起了研究者的極大興趣，也是目前干細(xì)胞研究方向的一個新熱點[10]，間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為多種人體組織細(xì)胞，具有非常廣泛的臨床應(yīng)用前景[11-12]。但有分離純化困難的缺點，探索一種新的獲取途徑和更好的分離培養(yǎng)技術(shù)具有重要的意義。骨髓、脂肪組織等途徑均可獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，兩種方法獲取的細(xì)胞數(shù)量較少，且與供者的身體狀況，身體機能，年齡等相關(guān)[13]，并且從骨髓中獲取干細(xì)胞給提供者帶來較大的痛苦。相比于其他獲取途徑，胎盤是獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的可靠而且豐富的來源，分離獲得的細(xì)胞具有容易分離，增殖快速，分化能力強等特點，同時具有提取方便，無痛苦，感染機會少等優(yōu)勢，且不涉及倫理道德問題[14-15]。不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有不同的生長能力[16]，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞活性較其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞活性較好。以往的研究多采用胰蛋白酶或多種消化酶聯(lián)合消化組織后獲取干細(xì)胞，但胰蛋白酶消化能力強，聯(lián)合消化常會過度消化損傷細(xì)胞膜成分[8]，容易影響細(xì)胞的成活率和增殖能力，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，給后續(xù)培養(yǎng)帶來困難。Ⅱ型膠原酶消化能力相對較弱，但對細(xì)胞膜損害較小，既能充分的分離細(xì)胞，又能避免細(xì)胞的損傷。利用組織塊法也能獲得一定數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞，但因其中可能混雜血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞成分，在后期的分離過程中，組織塊的清除也有一定的困難，難以保證所培養(yǎng)細(xì)胞的純度[17]。胎盤組織中含有血管內(nèi)皮細(xì)胞，血細(xì)胞及其他細(xì)胞，傳統(tǒng)酶消化后結(jié)合高速離心的方法將間充質(zhì)干細(xì)胞與其他細(xì)胞分離效果不理想。本研究采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行細(xì)胞分離，操作簡單并且獲取的細(xì)胞成分比較單一，為后續(xù)的培養(yǎng)帶來了方便。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞呈貼壁生長，可以利用此特性與其他雜細(xì)胞進(jìn)一步分離，但在培養(yǎng)早期，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁不牢固，第一次換液時間過早將損失獲取的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在重復(fù)的三次實驗中，由于組織的剪碎程度有差異及不同時間配制的消化酶濃度及環(huán)境溫度的影響，可能導(dǎo)致在初始階段獲取的細(xì)胞數(shù)量有一定差異，但經(jīng)培養(yǎng)及傳代后，細(xì)胞活性未見明顯差異。

胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志有一定的特異性，三次重復(fù)實驗的結(jié)果在表達(dá)上無明顯差異，在檢測的細(xì)胞比例上有一定的差異，這與實驗過程中細(xì)胞純化程度有關(guān)系，但獲取的細(xì)胞表達(dá)均>80%，可以滿足一般實驗的要求。有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞還可表達(dá)部分胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物，這可能提示胎盤來源的多能間充質(zhì)干細(xì)胞可能是非常原始的細(xì)胞群，與普通干細(xì)胞相比具有更加廣泛的多系分化能力[18],應(yīng)用前景將更加廣泛。進(jìn)一步探索一種更加高效地從胎盤中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法顯得非常有必要。

通過對胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性觀察及經(jīng)流式細(xì)胞鑒定提示采用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化已充分剪碎的胎盤組織可獲取較多數(shù)量的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，且活性較好。0.1%的Ⅱ型膠原酶消化30 min即可獲得大量細(xì)胞，延長時間至60 min，兩者間在細(xì)胞數(shù)量上無明顯差別，但消化時間的延長可能對細(xì)胞膜造成影響，后續(xù)的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)較長時間組增殖速度前期較慢，傳代后無明顯差異。所以通過機械剪碎胎盤組織結(jié)合使用Ⅱ型膠原酶消化可以縮短消化酶作用時間，更快捷的獲得胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞，有利于提高細(xì)胞成活率，生長活性、擴增和傳代培養(yǎng)。對于以上結(jié)果，本研究進(jìn)行了三次實驗驗證，說明通過機械剪碎胎盤組織，再使用0.1%的Ⅱ型膠原酶消化獲得胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法可靠性高，對比與之前獲取胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的途徑有簡單、高效、獲取細(xì)胞數(shù)量多、細(xì)胞活性好等優(yōu)點。這給臨床應(yīng)用提供了良好的基礎(chǔ)。

本研究雖然為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及傳代探索了一種相對于傳統(tǒng)的方法更加簡單、快捷、高效的方法。但仍存在一定的缺陷，如對傳統(tǒng)不同消化酶的比較，同種酶不同濃度的比較等。對于這些缺陷，需要進(jìn)一步的實驗進(jìn)行探索和驗證，最終尋找到一種可靠性更強、效率更高的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)體系，為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供扎實的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]袁文佶,黃穎芝,高瓔,等.人胎盤間充質(zhì)樣干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)特性分析[J].浙江大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版),2011,38(3):315-320.

[2]盧遙,鄧力,李秀群,等.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2007,21(9):989-993.

[3]孫曉娟.人足月胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離純化及生物學(xué)性狀的研究[D].青島：青島大學(xué),2010.

[4]沙文瓊,王自能,王冬菊.人胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,10:1833-1837.

[5]韓之波,楊舟鑫,池穎,等.人臍帶、胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較研究[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2012,20(3):692-696.

[6]劉洋,李艷琪,王洪一,等.胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的新方法[J].中國組織工程研究,2015(10):1608-1612.

[7]Koo BK,Park IY,Kim J,et al.Isolation and characterization of chorionic mesenchymal stromal cells from human full term placenta [J].J Korean Med Sci,2012,27(8):857-863.

[8]Chan TM,Harn HJ,Lin HP,et al. Improved human mesenchymal stem cell isolation[J].Cell Transplant,2014,23(4-5): 399-406.

[10]Patel J,Shafiee A,Wang W,et al. Novel isolation strategy to deliver pure fetal-origin and maternal-origin mesenchymal stem cell (MSC) populations from human term placenta[J]. Placenta,2014,35(11):969-971.

[11]Ni L,Liu X,Sochacki KR,et al. Effects of hypoxia on differentiation from human placenta-derived mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells[J].Spine J,2014,14(10):2451-2458.

[12]牛婷,李愛斌,曹景云,等.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用研究[J].中國組織工程研究,2015(32):5236-5242.

[13]張睿婷,韓之波,王濤,等.人胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(10):1823-1826.

[14]Zhu SF,Zhong ZN,Fu XF,et al.Comparison of cell proliferation, apoptosis, cellular morphology and ultrastructure between human umbilical cord and placenta-derived mesenchymal stem cells[J]. Neurosci Lett,2013,541:77-82.

[15]王敬龍,金巨樓,杜冰,等.胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的分子生物學(xué)特性[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版),2013,3(1):27-30.

[16]于艷秋.間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、臨床試驗與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國病理生理雜志,2015(10):1832-1832.

[17]馬海英,李麗,馬玲,等.組織塊貼壁法提取胎盤、臍帶和胎膜間充質(zhì)干細(xì)胞效果觀察[J].山東醫(yī)藥,2011,51(15):39-41.

[18] In 't Anker PS,Scherjon SA,Kleijburg-van der Keur C，et al.Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for therapeutic transplantation[J].Blood,2003,102(4):1548-1549.

Abstact:Objective:To investigate the feasibility of the combined use of mechanical minced placenta and enzymatic digestion to get and culture human placenta mesenchymal stem cells, and the biological identification of mesenchymal stem cells. Methods: Full-term human placenta was taken to seperate placental tissue cells by mechanical minced tissue joined with enzyme digestion. Placental tissue cells were purified by density gradient centrifugation, and further separated and purified with the growth characteristics of cells. Cells were observed under inverted microscope morphology and flow cytometry was adopted to identify cell surface markers. Results:Under inverted microscope, cells adherent growth, fusiform morphology, a small number of polygons were found. Placental tissues derived from mesenchymal stem cells in vitro could be long-term cultured stably. Flow cytometry showed that the expressions of CD73,CD90,CD105 were positive; the CD34,CD45,HLA-DR expressions were negative. Conclusion:Placenta derived mesenchymal stem cells can be efficiently obtained by the combined use of mechanical minced placenta and enzymatic digestion, can be cultured in vitro stably with high proliferative capacity, and can be long-term passed down or frozen.

Isolation, Cultivation and Biological Identification of Human Placenta Mesenchymal Stem Cells

LAIPing1,CHENYi-jian2a,LUOYao-ling2b,ZHANGMin-hong2b,YANGJian-qiong2b,QIUYue-qun2

(1.GraduateStudentinGrade2014,Gannanmedicaluniversity; 2.a.Dept.ofHematology;b.ClinicalResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Key words:human placenta mesenchymal stem cells; mechanically minced; enzymatic digestion; stem cells culture

*基金項目：江西省科技支撐計劃項目(編號20141BBG70069)

通訊作者：邱悅?cè)?，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mial:qiuyuequn66@sohu.com

中圖分類號：Q813.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-5779(2016)02-0183-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.005

(收稿日期：2015-12-04)(責(zé)任編輯：敖慧斌)