李曉東+徐世千+張建國+魯朝輝+于燕

摘要：以離體培養(yǎng)的百里香不定芽為材料，研究添加不同濃度苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）對(duì)不定芽生長過程中基礎(chǔ)生理代謝、精油提取率的影響。結(jié)果表明：添加供試濃度Phe、MJ顯著提高了百里香不定芽中可溶性蛋白、可溶性糖含量，其含量隨著Phe、MJ濃度的上升呈先上升后下降的趨勢(shì)；適宜濃度的Phe、MJ增強(qiáng)不定芽中SOD、POD、PAL活性，抑制PPO活性，且具有明顯的濃度效應(yīng)，其中添加100 mg/L Phe、150 mg/L MJ效果最佳。在此基礎(chǔ)上，提取了百里香精油，添加100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ的提取率分別為042%、0.39%，分別比對(duì)照（0.31%）高35.5%、25.8%。

關(guān)鍵詞：苯丙氨酸；茉莉酸甲酯；百里香；生理代謝；精油提取率

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0245-05

百里香（Thymus vulgaris L.）是唇形科（Lamiaceae）百里香屬（Thymus）多年生芳香植物，是一種重要的芳香和藥用植物，同時(shí)也可作為環(huán)保、觀賞以及蜜源植物，極具開發(fā)價(jià)值[1]。百里香植株花莖葉可提取芳香油，百里香精油是重要的天然香料、天然防腐劑以及天然抗氧化劑，具有廣泛的商業(yè)價(jià)值[2-4]，其主要成分百里酚、香芹酚可以預(yù)防和治療人類疾病[5]；同時(shí)百里香提取物還具有化感作用[6-7]，有望成為新型的生物除草劑。百里香精油的市場(chǎng)需求日益增大，但是野生百里香資源有限，而且栽培百里香的生長周期長且提取率很低。因此，人們開始嘗試?yán)酶鞣N途徑提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，其中刺激劑的利用是最有效的方法之一。

苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）是植物必需的一種氨基酸，它可以作為碳源以及通過參與蛋白質(zhì)的合成來影響植物的生長發(fā)育；同時(shí)，在植物細(xì)胞的次生代謝中，苯丙氨酸還是合成一些木質(zhì)素、生物堿、黃酮、異黃酮以及香豆素等次生物質(zhì)的重要前體[8]。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）是一類新確認(rèn)的植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能調(diào)節(jié)植物體保護(hù)酶活性及次生代謝酶類活性，促進(jìn)基因表達(dá)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)及次生物質(zhì)的合成[9]。已有研究表明，用10 μmol/L苯丙氨酸處理大豆懸浮細(xì)胞48 h后，懸浮細(xì)胞中大豆素含量增加為對(duì)照細(xì)胞的1.3倍，同時(shí)染料木素含量增加為對(duì)照的1.38倍[10]。羅建平等報(bào)道，用200 μmol/L茉莉酸甲酯處理懷槐懸浮培養(yǎng)細(xì)胞9 d后，可以使懸浮細(xì)胞中的異黃酮含量增加41718%[11]。本研究主要探討不同濃度的苯丙氨酸、茉莉酸甲酯處理對(duì)百里香不定芽中SOD、POD、PPO、PAL等保護(hù)酶活性以及可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響，從而篩選出最佳添加濃度并進(jìn)行精油的提取，為利用苯丙氨酸、茉莉酸甲酯調(diào)控百里香次生代謝產(chǎn)物含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為百里香（Thymus vulgaris L.）不定芽，品種名為冬季百里香。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

百里香不定芽培養(yǎng)的對(duì)照培養(yǎng)基為MS+0.25 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA，附加0.6%瓊脂、3%蔗糖；在對(duì)照培養(yǎng)基中分別添加50、100、150、200、250 mg/L苯丙氨酸組成5水平的苯丙氨酸處理培養(yǎng)基；在對(duì)照培養(yǎng)基中分別添加50、100、150、200、250 μmol/L茉莉酸甲酯組成5水平的茉莉酸甲酯處理培養(yǎng)基。滅菌前調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，其中苯丙氨酸、茉莉酸甲酯采用過濾滅菌，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種0.5 g不定芽，培養(yǎng)室溫度（25±2） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光照周期12 h/d。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

百里香不定芽生長60 d后，取各個(gè)處理的芽體較幼嫩部分0.5 g進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定可溶性蛋白鮮質(zhì)量含量；蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖鮮質(zhì)量含量；依據(jù)超氧化物歧化酶（SOD）抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光照下的還原程度來確定活性的大小，1 min 抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)SOD活性單位（U）；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，以1 min D470 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）；多酚氧化酶（PPO）采用兒茶酚法測(cè)定，以1 min內(nèi)D525 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）；苯丙氨酸解氨酶（PAL）采用紫外吸收法測(cè)定，以1 min D290 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）。以上生理指標(biāo)的測(cè)定均參照王學(xué)奎的方法[12]。

1.4 精油的提取

切取百里香全苗，于自然條件下陰干，然后粉碎并置于 1 L 圓底燒瓶中，按1 g ∶10 mL料液比加入蒸餾水。采用水蒸氣蒸餾法，蒸餾時(shí)間為微沸3.0～3.5 h，將揮發(fā)油經(jīng)正己烷萃取，保存于2 mL Agilent樣品瓶中，置于4 ℃冰箱中待測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)整理后輸入Excel 2007進(jìn)行處理，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同刺激劑濃度對(duì)百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

2.1.1 苯丙氨酸濃度對(duì)百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響 由圖1可以看出，添加50～250 mg/L Phe均不同程度地提高了不定芽中可溶性蛋白的含量，且添加物處理與對(duì)照相比，均達(dá)到了顯著差異（P<0.05）；當(dāng)加入 100 mg/L Phe時(shí)，不定芽中的可溶性蛋白質(zhì)的鮮質(zhì)量含量達(dá)到最高值3.21 mg/g，比對(duì)照極顯著提高了87.48%（P<001）；當(dāng)增加Phe的濃度時(shí)，其增加的幅度在下降。由此可知，Phe的最佳濃度為100 mg/L，可溶性糖含量反映了體內(nèi)作為有效營養(yǎng)物的碳水化合物和能量水平。

由圖2可以看出，添加Phe后對(duì)不定芽中可溶性糖的影響與可溶性蛋白的影響相似，各個(gè)Phe濃度的處理的可溶性糖含量均顯著高于對(duì)照組，其中100 mg/L Phe可溶性糖的鮮質(zhì)量含量高達(dá)7.89 mg/g，極顯著高于其他處理。

2.1.2 茉莉酸甲酯濃度對(duì)百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響 由圖3可以看出，在MJ處理下，極大地提高了不定芽中可溶性蛋白含量，說明添加MJ后細(xì)胞代謝更加活躍，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的大量合成。在50～150 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著MJ濃度的升高，促進(jìn)作用增強(qiáng)；MJ濃度為 150 μmol/L 時(shí)，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值7.66 mg/g，為對(duì)照的4.44倍；當(dāng)濃度超過150 μmol/L后，其促進(jìn)作用又開始下降，因此MJ最佳添加濃度為150 μmol/L。

由圖4可以看出，與對(duì)照相比，所有添加物處理都達(dá)到了極顯著差異且大部分處理之間都達(dá)到了極顯著差異（P<001），添加物處理的促進(jìn)作用隨著濃度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的規(guī)律變化，當(dāng)MJ添加濃度為150 μmol/L時(shí)，不定芽中可溶性糖含量達(dá)到最高值（7.69 mg/g，F(xiàn)W），比對(duì)照極顯著提高4919%（P<0.01）。

2.2 不同刺激劑對(duì)百里香不定芽中SOD、POD、PPO、PAL活性的影響

2.2.1 苯丙氨酸對(duì)百里香不定芽中SOD、POD活性的影響 由圖5可以看出，添加一定濃度Phe后，誘導(dǎo)了SOD活性增強(qiáng)，隨著濃度的升高，SOD活性表現(xiàn)為先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，存在1個(gè)最佳濃度100 mg/L，其值高達(dá) 723.12 U/（g·min），約為對(duì)照的1.09倍。當(dāng)Phe濃度超過100 mg/L時(shí)，其促進(jìn)作用隨著濃度的升高而下降；當(dāng)濃度為 250 mg/L 時(shí)，SOD活性明顯減弱，且顯著弱于對(duì)照（P<001），說明高濃度的Phe抑制了不定芽中SOD活性，使不定芽的抗氧化能力下降。

由圖6可以看出，所有添加物處理均不同程度地提高了不定芽中POD活性，與對(duì)照相比都達(dá)到了顯著差異。隨著Phe濃度的上升，POD活性的變化與SOD活性變化相似，也呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。當(dāng)添加濃度為100 mg/L時(shí)，POD活性最強(qiáng)，達(dá)到87.60 U/（g·min），約為對(duì)照的2.87倍。說明添加Phe后改善了植株的生理代謝，增強(qiáng)了POD活性，在一定程度上抑制了細(xì)胞因膜脂過氧化作用而引起的傷害。

2.2.2 苯丙氨酸對(duì)百里香不定芽中PPO、PAL活性的影響 由圖7可以看出，不同濃度的Phe對(duì)PPO的影響具有明顯的差異，隨著Phe濃度的升高，PPO活性呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢(shì)。在50～200 mg/L的濃度范圍內(nèi)，PPO的活性極顯著低于對(duì)照，其中100 mg/L Phe處理的PPO活性最弱，為194 U/（g·min），比對(duì)照極顯著降低了53.76%（P<0.01），說明添加適宜濃度的Phe后有效緩解了不定芽在生長后期的褐化現(xiàn)象。但當(dāng)濃度增加至250 mg/L時(shí)，其PPO活性迅速增強(qiáng)，并且高于對(duì)照，說明高濃度的Phe能誘導(dǎo)PPO活性增強(qiáng)，使得不定芽褐化加重。

由圖8可以看出，在不同濃度的Phe處理下，PAL活性極顯著強(qiáng)于對(duì)照，說明Phe的添加誘導(dǎo)了PAL活性的增強(qiáng)，從而有利于不定芽次生代謝物質(zhì)的合成和積累。隨著Phe濃度的升高，PAL活性的變化趨勢(shì)與PPO活性的變化趨勢(shì)相反，PAL活性表現(xiàn)為先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，存在一個(gè)最佳濃度（100 mg/L），其PAL活性高達(dá)14.92 U，極顯著高于其他處理，約為對(duì)照的9.62倍。

2.2.3 茉莉酸甲酯對(duì)百里香不定芽中S0D、POD活性的影響 由圖9可以看出，就濃度效應(yīng)來看，低濃度MJ極顯著地提高了不定芽中SOD活性，但高濃度MJ（250 μmol/L）卻也極顯著地抑制了SOD活性，MJ對(duì)SOD活性增強(qiáng)存在一個(gè)最佳濃度，即150 μmol/L，其SOD活性高達(dá)725.49 U/（g·min），約為對(duì)照的1.09倍。

由圖10可以看出，添加不同濃度的MJ后都不同程度地增強(qiáng)了不定芽中的POD活性，其中50～200 μmol/L濃度處理顯著高于對(duì)照處理（P<0.05），其中150 μmol/L MJ處理的POD活性最高，比對(duì)照顯著增強(qiáng)40.55%。 250 μmol/L MJ處理與對(duì)照差異不顯著。

2.2.4 茉莉酸甲酯對(duì)百里香不定芽中PPO、PAL活性的影響

由圖11可以看出，在50～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，PPO活性極顯著地低于對(duì)照，說明MJ的添加誘導(dǎo)了PPO活性的降低，從而可以緩解不定芽的褐化，延長不定芽的生長期。當(dāng)MJ的濃度為150 μmol/L，其PPO活性極顯著低于其他處理；當(dāng)繼續(xù)增加MJ濃度，PPO活性又開始上升，當(dāng)濃度增加到 250 μmol/L 時(shí)，PPO活性顯著高于對(duì)照，說明高濃度MJ可能使不定芽的褐化程度加重。

由圖12可以看出，當(dāng)添加MJ后，顯著增強(qiáng)了不定芽的中PAL活性，促進(jìn)了不定芽次生代謝的發(fā)生。在50～150 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，PAL活性隨著MJ濃度的升高而增強(qiáng)；但在150～250 μmol/L濃度范圍內(nèi)，PAL活性隨著MJ濃度的升高而降低，說明150 μmol/L為MJ的最佳添加量，其PAL活性最強(qiáng)，高達(dá)9.33 U/（g·min），約為對(duì)照的1472倍。

綜上可知，當(dāng)添加Phe、MJ濃度分別為100 mg/L、150 μmol/L 時(shí)，無論是不定芽的生物量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量還是代謝途徑中的各種酶活性都達(dá)到最佳水平，因此確定Phe、MJ調(diào)控百里香不定芽代謝的最適濃度分別為100 mg/L、150 μmol/L。

2.3 不同刺激劑對(duì)百里香精油提取率的影響

本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了最佳添加濃度的100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ對(duì)百里香精油提取率的影響。其中，添加 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ、未添加任何物質(zhì)的百里香不定芽中百里香精油的提取率分別為0.42%、0.39%、0.31%，所得精油均含有松油味以及特殊香氣，顏色無明顯差別，均為金黃色，且經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析，3種樣品精油均含有百里香酚、香芹酚、對(duì)傘花烴、石竹烯等百里香精油的主要化學(xué)成分?？梢?，經(jīng)100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ處理后促進(jìn)了百里香不定芽精油的合成，其提取率分別比對(duì)照高355%、25.8%。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，關(guān)于如何利用刺激劑來協(xié)迫植物細(xì)胞合成和積累次生代謝物已成為生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)[13]。很多研究已經(jīng)證明，生物的和非生物的刺激劑能有效調(diào)節(jié)次生代謝途徑，促進(jìn)目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的高水平合成。如在甘草懸浮培養(yǎng)體系中添加10 mg/L水楊酸可以顯著提高甘草總黃酮的含量[14]；徐立新等報(bào)道，在人參毛狀根培養(yǎng)基中添加0.001 mmol/L茉莉酸甲酯可以促進(jìn)人參皂苷的積累[15]；翟雪霞等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入 10 mg/L 苯丙氨酸，不僅可以明顯促進(jìn)紅豆杉愈傷組織的生長，并且能顯著提高紫杉醇含量，使其值高達(dá) 0.224%[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加50～250 mg/L苯丙氨酸和50～250 μmol/L 茉莉酸甲酯都能提高百里香不定芽的增殖系數(shù)，促進(jìn)生物量的大量積累，為植株進(jìn)行次生代謝奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

刺激劑的添加不僅使細(xì)胞積極合成了植物防衛(wèi)的次生代謝物質(zhì)，如植保素、木質(zhì)素等，同時(shí)也啟動(dòng)或加強(qiáng)了特定的次生代謝途徑，從而引起細(xì)胞的代謝變化，而這些代謝過程的發(fā)生主要是通過酶類的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的，蛋白質(zhì)含量的變化恰好反映了這些酶類的量變過程，其含量的高低可間接反映各種代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱[17]。王軍妮在桑樹試管苗培養(yǎng)時(shí)加入刺激劑Phe后，蛋白質(zhì)的含量發(fā)生了明顯的變化：桑葉中可溶性蛋白含量隨苯丙氨酸濃度的升高而升高[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加不同濃度的Phe、MJ后都不同程度地促進(jìn)了百里香不定芽中可溶性蛋白質(zhì)的含量，以100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ為最佳添加濃度，說明添加Phe、MJ后增強(qiáng)了百里香不定芽中各種代謝活動(dòng)，促進(jìn)了次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。

糖類是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一，糖的種類和用量不僅影響培養(yǎng)物生長量和生長速度，并且影響其代謝水平和次生代謝產(chǎn)物的合成[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在適宜濃度的Phe、MJ刺激下，百里香不定芽中的可溶性糖含量顯著升高，使不定芽因碳源充足而快速生長；同時(shí)，可溶性糖還具有滲透調(diào)節(jié)的作用，從而影響不定芽次生代謝產(chǎn)物的合成。

已有研究證明，刺激劑加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系后，大量自由基的產(chǎn)生誘發(fā)了自由基防御體系中酶保護(hù)系統(tǒng)的顯著變化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞自身的保護(hù)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加適宜濃度的Phe、MJ能使不定芽SOD、POD活性顯著增強(qiáng)，其中 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ效果最佳，說明添加這2種刺激劑有利于酶活性的表達(dá)，可以減輕活性氧積累，提高保護(hù)酶活性，使不定芽表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化能力，有效緩解各種脅迫對(duì)植物不利的影響，維持其正常的生理代謝功能。

PAL存在于所有綠色植物中，是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸[19]，程小萍等研究發(fā)現(xiàn)，酵母寡聚糖刺激劑可促進(jìn)丹參細(xì)胞內(nèi)PAL活性的增強(qiáng)，有利于丹參酮等次生代謝產(chǎn)物的合成[20]。嚴(yán)文文等也報(bào)道，在含有CoCl2的MS培養(yǎng)基中添加茉莉酸甲酯可以提高煙草愈傷組織中的PAL活性[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與CK相比，添加適量Phe、MJ后，能增強(qiáng)百里香不定芽中的PAL活性，且隨著濃度的上升，其活性增強(qiáng)的幅度在上升，其中 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ 處理的PAL活性分別達(dá)到1492、9.33 U/（g·min），極顯著高于其他處理，說明適宜濃度的Phe、MJ改善了百里香不定芽的生理代謝，促進(jìn)了其次生代謝產(chǎn)物的積累。

百里香作為重要的芳香植物，其精油的應(yīng)用價(jià)值高，但是目前關(guān)于離體培養(yǎng)條件下如何提高其精油含量的研究甚少。本試驗(yàn)通過苯丙氨酸、茉莉酸甲酯2種刺激劑對(duì)百里香不定芽生長增殖，不定芽中SOD、POD、PPO、PAL活性以及可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響，篩選出最佳苯丙氨酸（100 mg/L）、茉莉酸甲酯（150 μmol/L）的添加濃度，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行精油的提取，其精油得率有所提高，分別比對(duì)照高35.5%、25.8%，且精油的質(zhì)量良好，其主要化學(xué)成分沒有變化，均含有百里香酚、香芹酚、對(duì)傘花烴、石竹烯等百里香精油的主要化學(xué)成分，這為進(jìn)一步調(diào)控百里香次生代謝途徑、提高精油含量打下了一定的基礎(chǔ)。

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