王亞男　劉曉楠　戚偉　宋媛媛　張渝潔　成妮妮

【摘 要】α-法尼烯的合成及α-法尼烯合酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究在蘋果等虎皮病的防治中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用Tail-PCR技術(shù)克隆了青香蕉蘋果中α-法尼烯合酶基因的啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)度為1235bp。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子序列含有明顯的啟動(dòng)子特征序列TATA-box和CAAT-box，還有含有GARE-motif，TATC-box，TGA element等赤霉素和生長(zhǎng)素等激素響應(yīng)元件，HSE，ARE等熱脅迫響應(yīng)元件，大量的光反應(yīng)元件G-box，GA-motif，GAG-motif，以及MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS。序列分析表明該啟動(dòng)子可能受到激素、溫度和光的調(diào)節(jié)。

【關(guān)鍵詞】α-法尼烯合酶；啟動(dòng)子；虎皮病

α-法尼烯是一種普遍存在于植物體內(nèi)的倍半萜類次生代謝物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)果皮中α-法尼烯的生物合成是通過類異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑[1-2]。多年來的研究普遍認(rèn)為，在儲(chǔ)存過程中倍半萜α-法尼烯在果皮尤其是果皮蠟質(zhì)中的積累是引起蘋果和梨果實(shí)中的重大生理病害—虎皮病的主要原因[3-6]。Busatto等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，α-法尼烯及其氧化產(chǎn)物共軛三烯（CTols）一個(gè)新的作用即作為蘋果果實(shí)褐變的信號(hào)開關(guān)。研究表明蘋果虎皮病發(fā)生過程中多酚提取液的變化也與乙烯合成抑制劑1-MCP有關(guān)。這些代謝物積累的變化與參與這個(gè)途徑的基因以及兩種特異的揮發(fā)物α-法尼烯和共軛三烯（Ctols）的最終氧化形式6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）關(guān)系密切[7]，這與Whitaker等（2000）報(bào)道的MHO 與蘋果虎皮病發(fā)病率之間存在正相關(guān)關(guān)系，且只有在發(fā)病的果實(shí)上才能檢測(cè)到MHO一致[6]。候真等（2013）在研究MHO對(duì)蘋果虎皮病發(fā)生和果皮活性氧代謝的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，外源MHO可能通過降低抗氧化酶活性，進(jìn)而參與蘋果虎皮病的發(fā)病過程[8]。而Xie等（2014）研究還發(fā)現(xiàn)，梨（‘dAnjou，Pyrus communis L.）果實(shí)儲(chǔ)存過程中，在乙烯產(chǎn)生和成熟度與虎皮病發(fā)生方面對(duì)1-MCP非常敏感[9]。

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，α-法尼烯及其氧化產(chǎn)物與虎皮病發(fā)生關(guān)系密切，而α-法尼烯含量及α-法尼烯合酶表達(dá)模式可能受到1-MCP影響或乙烯的調(diào)節(jié)。因此，僅通過研究α-法尼烯合酶基因本身很難真正闡明虎皮病發(fā)生的分子機(jī)制，尤其是研究外界環(huán)境對(duì)虎皮病發(fā)生率的影響時(shí)，此時(shí)α-法尼烯的產(chǎn)生與其代謝途徑中的關(guān)鍵酶的表達(dá)量有重要關(guān)系。

本文擬通過分離α-法尼烯合成途徑的最后一個(gè)關(guān)鍵酶α-法尼烯合成酶基因的啟動(dòng)子序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究其所含有的順式作用元件，為下一步植物表達(dá)載體的構(gòu)建，以及光、激素、溫度、氧氣等因素對(duì)啟動(dòng)子調(diào)控的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青香蕉蘋果幼苗；大腸桿菌DH5α，本實(shí)驗(yàn)室保存；Ex Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，pMD18-T載體克隆試劑盒，Genome Walking Kit，購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。測(cè)序由上海生物工程有限完成。

1.2 方法

1.2.1 蘋果幼葉基因組DNA的提取

采用新型植物基因組提取試劑盒（DP320）（天根生化科技（北京）有限公司），具體步驟參照說明書。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

利用熱不對(duì)稱交織 PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，Tail-PCR）技術(shù)擴(kuò)增α-法尼烯合成酶基因的啟動(dòng)子序列。根據(jù)GenBank中注冊(cè)的青香蕉蘋果α-法尼烯合成酶基因（AFS）cDNA序列（張?jiān)?，李萌等?004，登錄號(hào)AY563622），在起始密碼子下游約400bp的長(zhǎng)度內(nèi)設(shè)計(jì)3條退火溫度較高（60℃以上）的特異引物SP1，SP2，SP3，引物方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向。同時(shí)設(shè)計(jì)了5條退火溫度較低（44℃）的簡(jiǎn)并引物。

特異引物：SP1： 5- GCCTAGTTTTCGGACGCTGTCAATG-3；SP2： 5-TTCCGATACTCATCTCCCTGC ACTCAGTT-3；SP3： 5- AGTAAG AGGCTTCAGGTTCGGGTTTCAT-3。

簡(jiǎn)并引物：Genome Walking Kit 自帶引物AP1-AP4。

1.2.3 Tail-PCR過程

PCR擴(kuò)增程序參照Genome Walking Kit說明書

第1次PCR：以獲得的青香蕉蘋果幼葉的基因組DNA為模板，以SP1分別與簡(jiǎn)并引物AP1-AP4配對(duì)，進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增。第2次PCR：將第1次PCR產(chǎn)物稀釋1000倍為模板，以SP2分別與AP1-AP4配對(duì)，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。第3次PCR：將第2次PCR產(chǎn)物稀釋500倍為模板，以SP3分別與AP1-AP4配對(duì)，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。每次反應(yīng)完成后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 產(chǎn)物回收及測(cè)序

用天根生化科技（北京）有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠回收第 3次 PCR產(chǎn)物較長(zhǎng)較亮片段，回收片段克隆進(jìn)pMD 18- T載體中并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 α-AFS啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用plantCARE結(jié)合PLACE在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)青香蕉蘋果的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)和比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3次Tail-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

圖1 三次TAIL-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

（A，B，C）分別代表1，2，3次TAIL-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。M：DNA Marker DL 2 000；泳道1，2，3，4分別代表特異引物與簡(jiǎn)并引物AP1-AP4分別配對(duì)的PCR產(chǎn)物。

由圖1A看出，各引物對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物都以彌散帶為主，從圖1B看出，第2次PCR中SP2與AP1組成的引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)兩條比較亮的條帶（泳道1），一條約750bp，一條約1400bp，其它3對(duì)引物出現(xiàn)2條200-300bp的條帶，其它帶較為彌散。圖1C看出，各引物對(duì)都出現(xiàn)750bp以上的較亮條帶，且每對(duì)引物的最大條帶豐度都較高。

2.2 目的片段回收及測(cè)序

分別切膠回收?qǐng)D 1 C泳道1和泳道4中較大的條帶（約1400bp），泳道2和泳道3中最亮的條帶（約1800bp）的PCR產(chǎn)物，克隆進(jìn)pMD 18-T 載體中測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示泳道1和泳道4的產(chǎn)物長(zhǎng)度為1320bp，與GenBank中注冊(cè)的青香蕉α-法尼烯合成酶基因cDNA序列（登錄號(hào)AY563622，張?jiān)?，李萌等?004）的重疊區(qū)域比較后，初步確定該序列為青香蕉蘋果中α-法尼烯合成酶基因的上游序列，命名為pAFS。而泳道2，3的產(chǎn)物長(zhǎng)度為1771，1863，但是在與青香蕉α-法尼烯合成酶基因cDNA重疊區(qū)比對(duì)時(shí)未發(fā)現(xiàn)重疊區(qū)序列，說明泳道2，3的產(chǎn)物為非目的帶。

2.3 pAFS啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析和順式作用元件預(yù)測(cè)

利用PLACE和PlantCARE 網(wǎng)站對(duì)pAFS片段進(jìn)行啟動(dòng)子元件的在線分析預(yù)測(cè)表明，該序列具有許多明顯的TATA框和CAAT框，同時(shí)還具有與激素相關(guān)的元件（圖2），如位于ATG上游-41和-65處以TATC-box為核心的赤霉素響應(yīng)元件TATCCCA，分別位于該片段負(fù)連-727和-904處的兩個(gè)GARE-motif序列AAACAGA是赤霉素反應(yīng)元件，位于ATG

上游負(fù)連上-192處的AACGAC是生長(zhǎng)素反應(yīng)元件。該序列負(fù)連的-1196還具有MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS，其核心序列為 TAACTG。以上各種元件的存在說明該序列的功能可能跟激素相關(guān)。同時(shí)，在ATG下游+34和負(fù)連的+48處分別有一個(gè)HSE元件AGAAAATTCT和ARE元件TGGTTT，前者參與熱脅迫反應(yīng)，后者是厭氧誘導(dǎo)所必須的，說明該啟動(dòng)子可能還受溫度和氧氣的調(diào)節(jié)。另外，該啟動(dòng)子還具有大量的與光反應(yīng)有關(guān)的元件如G-box，GA-motif，GAG-motif等。而且在ATG上下游附件各種調(diào)控元件相對(duì)集中。

3 討論

近年來，諸多研究表明蘋果虎皮病發(fā)生過程中，內(nèi)源乙烯的含量與α-法尼烯合酶基因的表達(dá)和α-法尼烯的含量具有一定的相關(guān)性，Pechous等（2005）等對(duì)AFS1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行Northern雜交的分析表明乙烯合成抑制劑-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理后，AFS1的mRNA在冷藏4周后則快速下降，到第8周則已經(jīng)幾乎檢測(cè)不到[10]。另有研究表明，在整體上，1-MCP處理的果實(shí)中α-法尼烯合酶基因的轉(zhuǎn)錄水平比未處理的要低[11]。這些實(shí)驗(yàn)都說明了乙烯誘導(dǎo)AFS1基因的轉(zhuǎn)錄。由α-法尼烯合酶表達(dá)模式受乙烯調(diào)節(jié)表明，該酶基因啟動(dòng)子可能有響應(yīng)乙烯調(diào)節(jié)的順式作用元件。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都為研究與乙烯誘導(dǎo)表達(dá)量增加有關(guān)的AFS基因啟動(dòng)子區(qū)域乙烯響應(yīng)元件提供了有價(jià)值的信息，很多實(shí)驗(yàn)室已開始著手對(duì)包含乙烯響應(yīng)元件的AFS基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆研究。

本實(shí)驗(yàn)利用熱不對(duì)稱交織PCR（Tail-PCR）技術(shù)，克隆了青香蕉蘋果中α-法尼烯合成酶基因起始密碼子ATG上游約1235bp及下游83bp序列，經(jīng)PLACE軟件分析后發(fā)現(xiàn)其具有多個(gè)啟動(dòng)子特征序列TATA-box和增強(qiáng)子特征序列CAAT-box，同時(shí)具有G-box等多個(gè)光反應(yīng)元件和多種激素反應(yīng)相關(guān)元件。在ATG下游還具有一個(gè)高溫反應(yīng)元件HSE，由此推測(cè)該序列具有啟動(dòng)子功能，且可能與激素、高溫、光等因素的調(diào)控相關(guān)。為了研究該啟動(dòng)子的核心區(qū)域及各調(diào)控元件的調(diào)控作用，我們目前正在利用啟動(dòng)子刪除技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建一系列與GUS報(bào)告基因相連的表達(dá)載體，通過GUS活性檢測(cè)，對(duì)啟動(dòng)子個(gè)序列的功能進(jìn)行更細(xì)致的研究。

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[責(zé)任編輯：楊玉潔]