李言 劉延嶺 崔翠菊 李曉捷 梁廣津 彭捷 田萍萍

（山東東方海洋科技股份有限公司 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心 山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，煙臺 264003）

海帶種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析

李言 劉延嶺 崔翠菊 李曉捷 梁廣津 彭捷 田萍萍

（山東東方海洋科技股份有限公司 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心 山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，煙臺 264003）

利用RAPD分子標記技術(shù)對種質(zhì)庫中保存的19個海帶品種（系）的36個海帶配子體進行了遺傳多樣性分析。從100條引物中篩選出16條可擴增出清晰條帶的引物，在36個海帶配子體中共擴增出362條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶比例達99.45%。遺傳相似性分析表明，這36個配子體之間的遺傳相似性范圍為0.682-0.978，以0.756為最低遺傳相似系數(shù)，可將36個種質(zhì)材料分為6個大類，UPGMA聚類分析結(jié)果表明同一品系的雌雄配子體大部分能聚在一起，品系間遺傳多樣性較高。

海帶；配子體；RAPD；遺傳多樣性

海帶（Saccharina japonica）是一種大型經(jīng)濟海藻，在醫(yī)藥、食品、化工等方面都有廣泛應用。在我國海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。目前我國海帶栽培面積37 282 hm2，產(chǎn)量1 017 737 t，多年來一直位居世界首位［1］。

海帶的生活史由二倍體的孢子體和單倍體的配子體組成，孢子體和配子體交替出現(xiàn)，是典型的異型世代交替。方宗熙等［2］最早提出，通過分離雌、雄單個配子體細胞，在連續(xù)光照條件下，可只進行營養(yǎng)生長長成絲狀體，即無性繁殖系（也稱配子體克隆系），這為海帶配子體保種技術(shù)和配子體克隆育苗技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。海帶孢子體是人工栽培的對象，個體大，占生活史時間長。海帶的配子體為微小的絲狀體，是種質(zhì)保存和人工培育苗種的對象［3］。20世紀50年代末以來，先后有20余個優(yōu)良品種（系）應用于生產(chǎn)，豐富了我國海帶栽培產(chǎn)業(yè)對品種的要求，同時也帶動了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。利用配子體克隆雜交進行海帶新品種的培育可獲得具有雜種優(yōu)勢雜交海帶，也可作為自交純化和定向選擇的基礎(chǔ)材料，“遠雜10號”、“901”海帶［4，5］、“榮福”海帶［6］、“東方2號”［7］、“東方3號”［8］和“東方6號”［9］海帶都是利用配子體克隆雜交技術(shù)進行直接雜交或雜交后定向選育得到的海帶品種。雜交海帶培育是目前效率較高的一種海帶遺傳改良方法。

海帶配子體克隆是海帶種質(zhì)資源的保存形式，也是海帶雜交育種育苗的材料。分離雌雄配子體進行海帶的種質(zhì)保存可以長期保持其優(yōu)良性狀和純度。對保存的配子體種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，了解不同品種（品系）間的親緣關(guān)系和遺傳關(guān)系，為海帶雜種優(yōu)勢利用奠定基礎(chǔ)，也為雜交育種選材提供參考。近年來，SSR、AFLP、RAPD和ISSR等分子標記技術(shù)均已用于海帶的遺傳多樣性分析［10］。其中Li等［11］利用微衛(wèi)星標記進行了配子體克隆親本遺傳相似性與子代性狀優(yōu)勢表現(xiàn)之間的關(guān)系分析，建立了海帶雜交優(yōu)勢預測體系，并在新品種培育中進行了應用。Zhang等［12］利用RAD技術(shù)對海帶配子體克隆群體進行測序，并利用得到的4 994個SNP標記構(gòu)建了海帶的高密度遺傳圖譜，將海帶配子體性別性狀和SNP基因型一起做連鎖分析，將配子體性別性狀定位在第二連鎖群上。石媛嫄等［13］利用微衛(wèi)星標記對海帶和長海帶配子體克隆遺傳資源在進行雜交后的親緣關(guān)系展開了分析和評價。Gu等［14］利用ISSR技術(shù)對榮福和901兩個海帶品種的配子體材料進行了遺傳變異分析，并開發(fā)了一個性別鑒定標記。Wang等［15］利用RAPD技術(shù)建立了33個海帶配子體的指紋圖譜。Wang等［16］利用ISSR技術(shù)對20個海帶配子體進行了遺傳多樣性分析。Shi等［17］利用ITS序列和RAPD技術(shù)對16個海帶配子體進行了遺傳關(guān)系研究。Bi等［18］利用RAPD技術(shù)對采自北方海區(qū)（大連、煙臺、威海和青島）的不同海帶孢子體群體進行了遺傳變異性分析。

本研究利用RAPD分子標記，對種質(zhì)庫中保存的我國海帶栽培品種（品系）中選育出的海帶種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，以期為海帶種質(zhì)評價奠定基礎(chǔ)，并為海帶配子體克隆新品種培育時親本的選擇提供指導，加快海帶品種改良進程。

1 材料與方法

1.1 材料

選取的36個海帶配子體材料分屬于19個海帶品種（品系），同一品種的雌雄配子體分別以f、m表示，這些配子體均從其品種（品系）培育完成時性狀整齊、優(yōu)勢明顯的當代孢子體中采集，保存在國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心海藻種質(zhì)庫，親本形態(tài)等信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 選取生長狀態(tài)良好的海帶配子體克隆，取0.1 g濕重的材料，采用改進的CTAB法提取配子體基因組DNA［19］，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度和純度。不同樣品的DNA濃度統(tǒng)一稀釋為40 ng/μL。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD引物的選擇和PCR反應參數(shù) 從候選的100條引物中篩選出16條能夠獲得清晰條帶、重復性好的引物，篩選出的引物見表2。

RAPD-PCR反應總體積為該體系（20 μL）為：1×PCR buffer，1.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，2.0 μmol/L 引物，40 ng 模板DNA，0.25 U Taq DNA 聚合酶（Promega）。

擴增PCR程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。Tanon 2500凝膠成像儀拍照記錄電泳結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 電泳圖譜的每一條帶為一個標記，代表一個引物的結(jié)合位點。根據(jù)各個分子標記的遷移率及其有無來統(tǒng)計數(shù)據(jù)，若有條帶出現(xiàn)記作1，若無條帶出現(xiàn)記作0。應用excel建立各引物的0、1數(shù)據(jù)庫。各引物的條帶多態(tài)性比例計算方法：多態(tài)位點比例P=（多態(tài)位點數(shù)/位點總數(shù)）×100%。用NTSYS2.10軟件計算遺傳相似性系數(shù)，采用UPGMA方法進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果

提取的海帶配子體DNA紫外分光光度計測定的A260/A280比值在1.9左右，濃度約為50-100 ng/μL，瓊脂糖電泳檢測條帶整齊，無降解和雜質(zhì)污染（圖

1），可滿足實驗需要。

表1 實驗中用到的海帶配子體

表2 選用的RAPD引物和擴增多態(tài)性信息

2.2 RAPD擴增結(jié)果多態(tài)性分析

16個RAPD引物對36個海帶種質(zhì)材料進行分析，共擴增得到362條清晰、重復性高的條帶，擴增片段大小都在200-3 700 bp之間，其中360條為多態(tài)條帶，總的多態(tài)條帶比率為99.4%，每條引物平均多態(tài)位點數(shù)為22.5（表2）。

圖1 部分樣品的DNA電泳圖

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測RAPD標記

圖3 36個海帶配子體的UPGMA聚類圖

2.3 遺傳多樣性分析

根據(jù)16條RAPD引物擴增所得結(jié)果計算海帶種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)，個體間的遺傳相似性系數(shù)變化范圍在0.682-0.978之間，個體之間的親緣關(guān)系較近，但也存在一定的差異，總體來看遺傳多樣性較高（表3）。根據(jù)RAPD標記數(shù)據(jù)計算材料間的遺傳相似系數(shù)矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類圖（圖3），36個種質(zhì)資源被聚為若干個類群，

其中每個類群又包括若干亞類。整體上分析，同一品種（品系）的雌雄配子體基本上都聚在較近位置，在相似系數(shù)為0.756時，主要分為6個（a-f）類型，其中a類型包括的種質(zhì)數(shù)目最多，有20個，表明這20個種質(zhì)資源與其他16個之間的親緣關(guān)系差異較大。其中11f與12m、12f聚在f分支上；同聚在e分枝的3m與8m、8f親緣關(guān)系最近；雖然9m與9f同聚在d分枝上，但兩者的遺傳相似度僅為0.760。

表3 36個海帶配子體的SM 遺傳相似系數(shù)表

聚類結(jié)果與種質(zhì)采集的地理分布、長期人工栽培環(huán)境等因素具有一定的相關(guān)性，由于長期的人工栽培和環(huán)境的適應以及人為的干擾，引起某些自身遺傳性狀的改變，使得栽培品種的遺傳差異逐漸變??；所以在育種過程中，若想進行優(yōu)良品系的選育，要適當選擇遺傳差異較大的種質(zhì)材料作為育種的親本，將會獲得較好的效果。

3 討論

RAPD、SSR、AFLP和ISSR等分子標記技術(shù)被廣泛用于海藻種質(zhì)資源評價、連鎖圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析等領(lǐng)域［20-22］。新型的分子標記SNP雖然有數(shù)量上的優(yōu)勢，但目前若要大批量檢測應用還存在技術(shù)和經(jīng)費的限制；AFLP標記對DNA質(zhì)量要求很高，且需要進行限制性內(nèi)切酶切和檢測體系都比較繁瑣；SSR分子標記檢測體系穩(wěn)定，而本實驗在選擇標記時也曾用過SSR標記，但在所選品系間的多態(tài)性較低，不能較好地反映品系間的遺傳多樣性。而RAPD標記具有很大的隨機性，可以覆蓋整個基因組，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，可以反映整個基因組的變化，多態(tài)性高且操作步驟簡便快速，只需要PCR后用瓊脂糖膠檢測即可反映出結(jié)果。雖然RAPD標記也存在不足之處，如穩(wěn)定性和重復性較弱，對PCR反應條件敏感等。但在本研究預實驗時，對RAPD的反應條件進行了優(yōu)化，且每個擴增反應均進行了3次重復，在進行條件統(tǒng)計時選取清晰且具有重現(xiàn)性的條帶，在較大程度上保證了結(jié)果的準確性。

近年來，RAPD標記技術(shù)在陸地植物和藻類學研究中應用都較為廣泛，常被用來進行種群的遺傳變異分析和多樣性評價。Desai等［23］利用RAPD技術(shù)對13個不同基因型的竹子品系進行了遺傳多樣性分析；Ma等［24］用RAPD分子標記對黑麥屬的18個品種（系）進行了遺傳關(guān)系分析；夏鵬等［25］以“901”海帶為材料進行了RAPD體系的優(yōu)化；周志剛等［26］應用同功酶和RAPD技術(shù)對中國海區(qū)不同栽培品系及長海帶的配子體進行了遺傳多樣性分析；He等［27］利用RAPD對海帶資源進行了種質(zhì)評價。諸多研究中雖然選用的實驗材料不盡相同，但結(jié)果均顯示海帶資源具有較高的遺傳多樣性，可見RAPD技術(shù)穩(wěn)定性較好，可用于海帶種質(zhì)資源評價。

實驗室種質(zhì)庫選取性狀表現(xiàn)穩(wěn)定的優(yōu)良品系進行種質(zhì)的采集和保存，將雌雄配子體分別保存，可長期保持其優(yōu)良性狀和純度。本研究選取的這19個海帶品種（品系），有兩個是野生海帶品系（7m，7f），1個榮遠緣-1（3m）和1個利尻海帶（11f），因種質(zhì)保存時間較長，部分種質(zhì)材料因自身或外界環(huán)境原因?qū)е聵s遠緣-1和利尻的配子體只有單雌或單雄配子體。其余的15個品系均為曾經(jīng)或現(xiàn)在的主要海帶栽培品系，選取的配子體均采自品種或品系育成時，性狀表現(xiàn)整齊、穩(wěn)定的株系。王秀良等［20］用RAPD的方法對海帶配子體進行分析時發(fā)現(xiàn)大多數(shù)來源于同一品系的雌雄配子體均不能聚在一起，其分析原因可能是不同品系之間盡管存在表型性狀的差異，但仍屬于同一種，遺傳關(guān)系近，所以不同品系的雌雄配子體會聚在一起，另外，來源于同一品系，雌雄配子體是由游孢子萌發(fā)而來，在減數(shù)分裂的過程中有可能發(fā)生基因重組，導致同一品系的雌雄配子體不能聚在一起。但本實驗中這種現(xiàn)象并不明顯，分析結(jié)果時發(fā)現(xiàn)這19個品系的遺傳多樣性較高，而且同一品系的雌雄配子體大多數(shù)都能聚在一起，只有少數(shù)幾個品系的雌雄配子體不能完全聚在一起，但親緣關(guān)系也比較近，如6f和6m、1f和1m，說明采集配子體的品系個體純度較高，而且在保存的過程中配子體變異率很低。Wang等［16］用ISSR技術(shù)對10對海帶配子體進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)同一品系的雌雄配子體基本聚在一支上，與本研究結(jié)果一致。

海帶配子體作為種質(zhì)資源的保存形式，也是雜交海帶育種育苗的重要材料，分離雌雄配子體分別保存可以長期保持其優(yōu)良性狀和純度，同時也在很大程度上避免了大田孢子體逐代選種和混采混育所導致的種質(zhì)退化和混雜問題。本研究對種質(zhì)庫中保存的部分配子體進行遺傳多樣性分析，了解其不同品種（品系）間的親緣關(guān)系，為海帶配子體克隆新品種培育時親本的選擇提供指導，加快海帶品種改良進程。

4 結(jié)論

利用RAPD分子標記技術(shù)對19個海帶品種（系）的36個海帶配子體進行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，可將36個種質(zhì)材料分為6個大類，同一品系的雌雄配子體大 部分能聚在一起，品系間 遺傳多樣性較高。

［1］農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局. 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè) 出版社, 2014.

［2］曾呈奎, 王素娟, 劉思儉, 等. 海藻栽培學［M］. 上海：上?？茖W技術(shù)出版社, 198 5：55-121.

［3］方宗熙, 歐毓麟, 崔競進, 等. 海帶配子體無性繁殖系培育成功［J］. 科學通報, 1978, 2：115-116.

［4］ 張全勝, 劉升平, 曲善村, 等. “901”海帶新品種培育的研究［J］.海洋湖沼通報, 2001（2）：46-53.

［5］Zhang QS, Tang XX, Cong YZ, et al. Breeding of an elite Laminaria variety 90-1 through inter-specific gametophyte crossing［J］. Journal of Applied Phycology, 2007, 19：303-311.

［6］Zhang J, Liu Y, Yu D, et al. Study on high-temperature-resistant and high-yield Laminaria variety “Rongfu”［J］. Journal of Applied Phycology, 2011, 23：165-171.

［7］Li XJ, Cong YZ, Yang GP, et al. Trait evaluation and trial cultivation of Dongfang No. 2, the hybrid of a male gametophyte clone of Laminaria longissima（Laminariales, Phaeophyta）and a female one of L. japonica［J］. Journal of Applied Phycology, 2007, 19：139-151.

［8］Li XJ, Liu JL, Cong YZ, et al. Breeding and trial cultivatipn of Dongfang No. 3, a hybrid of Laminaria gametophyte clones with a more than intraspecific less than interspecific relationship［J］. Aquaculture, 2008, 280：76-80.

［9］Li XJ, Zhang ZZ, Qu SC, et al. Breeding of an intraspecific kelp hybri d Dongfang no. 6（Saccharina japonica, Ph aeophyceae, Laminariales）for suitable processing products and evaluation of its culture performance［J］. Journal of Applied Phycology, 2016, 28（1）：439-447.

［10］劉福利, 王飛久, 孫修濤, 等. 分子育種及其在海帶育種中的研究進展［J］. 海洋科學, 2012, 36（9）：128-134.

［11］Li XJ, Yang GP, Shi YY, et al. Prediction of the heterosis of Laminaria hybrids with the genetic distance between their parental gametophyte clones［J］. Journal of Applied Phycology, 2008, 20（6）：1097-1102.

［12］Zhang N, Zhang LN, Tao Y, et al. Construction of a high density SNP linkage map of kelp（Saccharina japonica）by sequencing Taq I site associated DNA and mapping of a sex determining locus［J］. BMC Genomics, 2015, 16：189.

［13］石媛嫄, 楊官品, 廖梅杰, 等. 海帶和長海帶配子體無性繁殖系微衛(wèi)星DNA多態(tài)性比較分析［J］. 中國海洋大學學報, 2008, 38（1）：303-308.

［14］Gu JG, Sun YP, Liu Y. Sex identification and genetic variation of Saccharina（phaeophyta）gametophytes as revealed by intersimple sequence repeat（ISSR）markers［J］. Journal of Applied Phycology, 2014, 26（1）：635-646.

［15］Wang XL, Yang YX, Cong YZ, et al. DNA fingerprinting of selected Laminaria（Phaeophyta）gametophytes by RAPD markers［J］. Aquaculture, 2004, 238：143-153.

［16］Wang XL, Liu CL, Li XJ, et al. Assessment of genetic diversities of selected Laminaria（Laminariales, Phaeophyta）gametophytes by inter-simple sequence repeat analysis［J］. Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47（6）：753-758.

［17］Shi CJ, Hu ZM, He YJ, et al. Identification and assessing the cultivars of Laminaria Lamx. （Phaeophyceae）with molecular markers［J］. Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47（3）：283-291.

［18］Bi YH, Hu YJ, Zhou ZG. Genetic variation of Laminaria japonica（Phaeophyta）populations in China as revealed by RAPD markers［J］. Acta Oceanologica Sinica, 2011, 30（2）：103-112.

［19］李言, 崔翠菊, 羅世菊, 等. 海帶屬配子體DNA 提取及ISSRPCR體系優(yōu)化［J］. 農(nóng)學學報, 2014, 4（11）：80-84.

［20］王秀良. RAPD和ISSR標記在海帶種質(zhì)及其遺傳多樣性研究中的應用［D］. 青島：中國科學院海洋研究所, 2005.

［21］石媛嫄. 海帶連鎖圖譜構(gòu)建及東方2號雜交海帶親緣關(guān)系分析［D］. 青島：中國海洋大學, 2008.

［22］張全勝, 石媛嫄, 叢義周, 等. 我國引種海帶和栽培品種（系）來源配子體克隆的AFLP分析［J］. 中國海洋大學學報, 2008, 38（3）：429-435.

［23］Desai P, Gajera B, Mankad M, et al. Comparative assessment of genetic diversity among Indian bamboo genotypes using RAPD and ISSR markers［J］. Molecular Biology Reports, 2015, 42（8）：1265-1273.

［24］Ma X, Gu XY, Chen TT, et al. Genetic relationships between Lolium（Poaceae）species revealed by RAPD markers［J］. Genetics and Molecular Research, 2013, 12（3）：3246-3255.

［25］夏鵬, 楊迎霞, 劉升平, 等. 海帶“901”配子體DNA隨機擴增反應條件的優(yōu)化［J］. 海洋科學, 2003, 27（5）：22-26.

［26］周志剛, 史西志, 胡遠皆, 等. 中國海區(qū)不同養(yǎng)殖品系海帶與長海帶之間的遺傳關(guān)系［J］. 中國水產(chǎn)科學, 2003, 10（6）：474-480.

［27］He YJ, Zou YP, Wang XD, et al. Assessing the germplasm of Laminaria（Phaeophyceae）with random amplified polymorphic DNA（RAPD）method［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2003, 21（2）：141-148.

（責任編輯 馬鑫）

RAPD Analysis of Genetic Diversity in Saccharina japonica Germplasm Resources

LI Yan LIU Yan-ling CUI Cui-ju LI Xiao-jie LIANG Guang-jin PENG Jie TIAN Ping-ping
（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd.，National Algae and Sea Cucumber Project Technology Research Centre，Key Laboratory of Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology of Shandong Province，Yantai 264003）

The genetic diversity of 36 gametophytes of 19 varieties（or lines）of Saccharina japonica was analyzed with RAPD（random amplified polymorphic DNA）markers. Sixteen primers with clear bands were selected out from 100 primers for diversity analysis. These primers amplified 362 DNA bands from 36 gametophytes，and 99.45% of the bands were polymorphic. The genetic similarity of the 36 gametophytes ranged from 0.682-0.978. The 36 gametophytes germplasm were clustered into 6 groups while 0.756 was as the minimum genetic similarity coefficient. The UPGMA cluster results indicated that the male and female gametophyte of the same species were clustered together，and genetic diversity among species was high.

kelp；gametophyte；RAPD；genetic diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.020

2015-07-02

國家科技支撐計劃項目（2012BAD55G01），國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）項目（2012AA10A406），煙臺市科技發(fā)展計劃項目（2013LGS002）

李言，女，碩士，研究方向：藻類遺傳學；E-mail：liyan-pig@163.com

崔翠菊，女，博士，研究方向：海藻分子生物學和遺傳育種；E-mail：cuicuiju@163.com