陳以衡 陶姝宇 劉旭平 譚文松

（華東理工大學 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

微載體濃度與細胞接種密度對 ST 細胞生長的影響

陳以衡 陶姝宇 劉旭平 譚文松

（華東理工大學 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

選擇合適的微載體濃度、細胞接種密度以提高微載體利用率，優(yōu)化微載體培養(yǎng)體系豬睪丸細胞（Swine testicle cells）的貼附生長與維持。使用DMEM補加10%血清、LSM（Low serum medium）兩種培養(yǎng)基考察微載體濃度、細胞接種密度對細胞生長維持的影響，進而比較ST細胞在不同條件下對Cytodex 1微載體的利用率。結(jié)果顯示，使用LSM在T150方瓶中連續(xù)傳代培養(yǎng)30 d，平均比生長速率為0.626 d-1，是DMEM補加10%FBS培養(yǎng)基的1.15倍。選擇10×105cells/mL細胞接種3 g/L Cytodex 1攪拌瓶體系，最大細胞密度為38.3×105cells/mL，微載體利用率上升到58.8%。在灌注培養(yǎng)體系中培養(yǎng)ST細胞15 d，最終細胞密度達到36.6×105cells/mL，擴增了13.6倍。微載體懸浮培養(yǎng)的使用一方面有利于ST細胞的貼附與生長，實現(xiàn)高密度生長，另一方面增加了微載體的使用成本，選擇合適的微載體濃度、細胞接種密度，能夠最大化利用微載體與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)實現(xiàn)細胞的最優(yōu)生長。

微載體；ST細胞；豬瘟病毒；細胞密度

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、發(fā)熱、高度接觸性的嚴重傳染病［1］。由于豬瘟流行爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)、國際貿(mào)易和食品安全帶來的嚴重危害，世界動物衛(wèi)生組織（OIE，2002）將豬瘟列為法定必須上報的動物傳染病之一，我國出臺的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》中也將其列為優(yōu)先防治的五種一類動物疫病之一［2，3］。目前國內(nèi)貫徹預防為主的方針，免疫接種豬群豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）應(yīng)對全國各個地區(qū)豬瘟的不間斷散發(fā)流行［4］。

豬睪丸細胞系（ST）與豬同源，是豬瘟病毒最為易感的細胞系之一，能穩(wěn)定豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝并有效提高病毒滴度，在豬瘟細胞源疫苗研究中被廣泛使用［5，6］。目前利用ST細胞生產(chǎn)豬瘟疫苗大多采用傳統(tǒng)的滾瓶貼壁培養(yǎng)工藝，操作過程繁瑣，疫苗產(chǎn)量有限［7］。微載體懸浮培養(yǎng)體系具有比表面積大、易檢測、易控制等優(yōu)點，能為細胞生長及病毒增殖提供相對優(yōu)良、恒定的培養(yǎng)環(huán)境，在細胞源疫苗生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用，如狂犬病疫苗、流感疫苗等［8-11］。建立穩(wěn)定高效的ST細胞微載體培養(yǎng)體系，能克服滾瓶培養(yǎng)工藝的缺陷，是大規(guī)模生產(chǎn)細胞源豬瘟疫苗的重要基礎(chǔ)。

許多研究表明，細胞的生長與細胞接種密度和微載體濃度密切相關(guān)［12-19］。一般細胞接種密度越高，最高活細胞密度（Viable cell density，VCD）也越高，但易引起營養(yǎng)物的不足與代謝副產(chǎn)物累積造成難以維持高細胞密度，而較低的接種密度可能使初始細胞量與微載體的比例過低，影響初期細胞與微載體的接觸及黏附，微載體空球現(xiàn)象增加；相應(yīng)地，提高微載體濃度可以增加貼壁面積，但同時微載體之間碰撞的幾率增加，造成細胞損傷機會也增多，細胞擴增倍數(shù)未能按理想狀況成比例增加，此時，過高濃度的微載體會增加成本。因此，在ST細胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中，選擇合適的微載體濃度與細胞接種密度提高微載體利用率，對細胞增殖、維持和后期接種病毒的擴增效率尤為重要。

本研究在本實驗室前期自行設(shè)計開發(fā)的ST細胞低血清貼壁培養(yǎng)基與DMEM+10%FBS兩種培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，考察微載體濃度及細胞接種密度對細胞生長代謝的影響，旨在提高微載體利用率，并在灌注培養(yǎng)體系初步實現(xiàn)ST細胞的培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用貼壁依賴型豬睪丸傳代細胞系ST細胞株（Swine testis cells）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。貼壁型ST細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基：DMEM（Gibco公司）補加3.7 g/L碳酸氫鈉（Amresco公司），添加10%胎牛血清FBS（Fatal Bovine Serum，南京Wisent公司）。

貼壁型ST細胞培養(yǎng)用低血清培養(yǎng)基：本實驗室自行設(shè)計開發(fā)，包括葡萄糖、氨基酸、維生素、無機鹽和金屬離子等成分，補加1%FBS。

1.2 方法

1.2.1 ST細胞培養(yǎng)方法

1.2.1.1 ST細胞方瓶培養(yǎng) 待貼壁型ST細胞生長至鋪滿方瓶（TPP公司）底部約80%-90%時，吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗2-3次，加入0.25%（W/V）胰酶（Sigma公司）-0.05%（W/V）EDTA（Sigma 公司）消化液置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，當細胞收縮變圓，輕搖方瓶至脫落時，稀釋接種，接種密度為2×105-3×105cells/mL。

1.2.1.2 ST細胞攪拌瓶貼壁培養(yǎng) 所用微載體為Cytodex 1（GE Healthcare）。稱量所需微載體于125 mL攪拌瓶（Corning 公司），PBS洗滌3次至微載體水化、膨脹完全后去除多余PBS，121℃濕熱滅菌30 min待用。將消化后的細胞種子液接種至裝有微載體的無菌攪拌瓶，培養(yǎng)液體積為100 mL，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中攪拌平臺（INTEGRA）培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為50 r/min，每24 h取樣進行細胞計數(shù)與代謝分析。

1.2.1.3 ST細胞灌注培養(yǎng) 采用自制灌注培養(yǎng)設(shè)備進行細胞灌注培養(yǎng)。如圖1所示，該裝置主要由灌注培養(yǎng)腔（120 mL）、培養(yǎng)基存貯瓶（120 mL）、灌注循環(huán)系統(tǒng)構(gòu)成。使用3 g FibraCel disk 微載體（NBS公司）。將消化后的細胞種子液轉(zhuǎn)移到經(jīng)高壓滅菌的灌注培養(yǎng)裝置中，接種密度2×105cells/mL于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行灌注培養(yǎng)，控制培養(yǎng)基流速為2.5 mL/min，每24 h取樣進行代謝分析，每3 d進行存貯瓶全換液，培養(yǎng)15 d后取出微載體進行細胞密度檢測。

圖1 灌注培養(yǎng)體系裝置與示意圖

1.2.2 有關(guān)操作參數(shù)的實驗方法

1.2.2.1 微載體濃度對ST細胞生長代謝的影響 將5×105cells/mL ST細胞接種至125 mL攪拌瓶，攪拌瓶中微載體用量分別為1、3、5和7 g/L。

1.2.2.2 細胞接種密度對ST細胞生長代謝的影響 接種微載體用量為3 g/L的125 mL攪拌瓶，接種密度分別為1×105、3×105、5×105和10×105cells/mL。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 細胞密度與增殖參數(shù)測定 微載體上貼附生長的細胞以0.1%低滲結(jié)晶（貝基生物科技有限公司）-0.1 mol/L檸檬酸（Sigma公司）染液染色，臺式振蕩器37oC振蕩過夜，PBS稀釋至適當濃度后用血球計數(shù)板計數(shù)紫色細胞核。

1.2.3.2 DNA含量檢測 取10片disk于EP管中，PBS漂洗后，經(jīng)1 mL 0.5 g/L木瓜蛋白酶（Sigma公司）恒溫水浴鍋60℃孵育24 h，-20℃凍存待用。事先配制100 ng/mL Hoechst 33258（Invitrogen公司）TNE溶液，并提取2.68×106cells/mL細胞懸液所含DNA，按Hoechst熒光定量法在350 nm波長下使用核酸蛋白熒光分析儀（Bio-Rad）測量熒光強度并繪制DNA標準曲線，取5 μL樣品DNA進行含量測定并換算成細胞密度。

1.2.3.3 攪拌瓶中細胞培養(yǎng)的代謝物濃度測定 葡萄糖濃度測定采用葡萄糖試劑盒（上?？菩郎镌噭┕荆僮靼词褂谜f明書進行。乳酸濃度測定采用乳酸測定試劑盒（南京建成生物工程公司），操作按使用說明書進行。氨濃度采用尿素氮試劑盒（上海申索試劑有限公司）測定，操作按使用說明書進行。

1.2.3.4 灌注裝置中細胞培養(yǎng)代謝物濃度測定 培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸、氨的濃度和pH值均采用全自動生化分析儀BioProfile 400 Analyzer測定。

1.2.4 計算方法

1.2.4.1 細胞比生長速率的計算 比生長速率μ通過以下公式計算：

式中，XV：活細胞密度（106cells/mL），t：培養(yǎng)時間（d）。

1.2.4.2 葡萄糖比消耗速率、乳酸比生產(chǎn)速率的計算 葡萄糖的比消耗速率和乳酸的比生成速率計算方法相似，以葡萄糖比消耗速率為例，通過以下公式計算：

式中，qgluc：葡萄糖的比消耗速率（mmol/109cells/ day），代表細胞消耗葡萄糖的速率；P：葡萄糖的濃度（mmol/L）；IVC：微載體上貼附生長的總細胞數(shù)目對時間的積分（109cells·day）。

1.2.4.3 乳酸對葡萄糖的轉(zhuǎn)化率的計算 乳酸對葡萄糖轉(zhuǎn)化率Ylac/gluc（mmol/mmol）通過下式計算。

2 結(jié)果

2.1 兩種培養(yǎng)基中ST細胞增殖能力比較

分別使用DMEM和LSM兩種培養(yǎng)基在T150方瓶中連續(xù)傳代培養(yǎng)ST細胞30 d，比較兩者ST細胞比生長速率。ST細胞在DMEM培養(yǎng)基中平均比生長速率為0.545 d-1（圖3-A）；在LSM培養(yǎng)基中，ST細胞平均比生長速率為0.626 d-1（圖3-B）。相比DMEM培養(yǎng)基，ST細胞在LSM中以更高的比生長速率連續(xù)穩(wěn)定傳代。

2.2 微載體濃度對細胞生長代謝的影響

圖3-A是使用DMEM培養(yǎng)基攪拌瓶培養(yǎng)體系，不同微載體濃度條件下ST細胞密度隨時間的變化。固定細胞接種密度為5.0×105cells/mL時，4個條件下的ST細胞密度在接種后24 h內(nèi)細胞密度變化基本一致，且均在第3天達到最大，分別為16.6×105、14.6×105、15.1×105和9.5×105cells/mL。隨著微載體濃度的上升，最大細胞密度不升反降，在微載體濃度為7 g/L條件下，細胞生長緩慢僅擴增0.9倍。從ST細胞增殖情況較好5 g/L微載體濃度的倒置顯微鏡明場（圖3-C）可以看出，使用DMEM培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中始終存在微載體未貼滿的現(xiàn)象。

圖2 ST細胞T150方瓶連續(xù)傳代曲線

圖3 不同微載體濃度條件下ST細胞生長曲線與貼附情況（40×）

對比圖3-B使用LSM培養(yǎng)基攪拌瓶體系培養(yǎng)ST細胞，4組不同微載體濃度實驗組ST細胞密度分別在第4天、第7天、第9天、第10天時達到最大，為 23.2×105、29.3×105、39.6×105和 47.4×105cells/mL，均顯著高于相同條件下DMEM培養(yǎng)基對應(yīng)實驗組的最大細胞密度。1 g/L微載體用量的實驗組在第4天細胞密度達到最大后，存在一個維持了5 d的平臺期。并且從該條件下ST細胞顯微鏡明場（圖3-D）也可以看出，培養(yǎng)過程中，微載體幾乎始終處于滿球的狀態(tài)。

從細胞培養(yǎng)中葡萄糖、乳酸和氨的濃度變化來看，使用LSM葡萄糖消耗情況并未有顯著差別，4個微載體濃度條件下第13天葡萄糖濃度分別為5.60、5.99、3.23和1.88 mmol/L（圖4-A）。氨均未大量生成，培養(yǎng)結(jié)束時分別為3.77、4.56、3.81和3.23 mmol/L（圖4-C）。而副產(chǎn)物乳酸在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)持續(xù)累積的情況，培養(yǎng)結(jié)束時分別為17.2、20.7、13.4和11.3 mmol/L（圖4-B）。從圖4-D可以看出，微載體濃度為7 g/L的條件下乳酸對葡萄糖的得率最低，3 g/L條件下該得率最高。

根據(jù)單個ST細胞貼壁面積約為200 μm2，每克Cytodex 1能提供的生長表面積為4 400 cm2。計算不同濃度微載體理論最高ST細胞密度，并與實際值相比得到微載體的利用率進行比較（表1）發(fā)現(xiàn)，3 g/L的微載體用量既能提供充足的貼壁面積，又能保持較高的微載體利用率，所以使用該濃度進一步研究細胞接種密度對細胞生長的影響。

圖4 LSM不同微載體濃度對ST細胞代謝的影響

表 1 LSM不同微載體濃度條件下的微載體利用率

2.3 細胞接種密度對細胞生長代謝的影響

圖5-A是使用DMEM培養(yǎng)基攪拌瓶培養(yǎng)體系，不同ST細胞接種密度條件下細胞密度隨時間的變化。固定微載體濃度為3 g/L時，不同細胞接種密度條件下，4個實驗組分別在第2天、第3天、第5天和第6天達到最大細胞密度，分別為17.4×105、16.2×105、15.9×105和14.4×105cells/mL，并沒有顯著差異。對比圖5-B，使用LSM攪拌瓶培養(yǎng)體系考察細胞接種密度對細胞生長的影響，當微載體濃度為3 g/L，不同細胞接種密度分別出現(xiàn)在第5天，第6天、第7天、第8天達到最大細胞密度，為37.9×105、29.4×105、29.3×105和 27.1×105cells/ mL，與初始接種密度相比，分別增殖了2.88倍、4.86倍、8.80倍 和26.10倍。IVCC分別為38.1×109、26.7×109、25.2×109和20.5×109cells.d/L。微載體利用率分別為57.4%、44.5%、44.4%和41.0%。

圖5 不同細胞接種密度條件下ST細胞貼壁生長曲線

圖6 LSM不同ST細胞接種密度條件下對細胞代謝的影響

從細胞培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸和氨的濃度變化來看，使用LSM葡萄糖消耗趨勢并未有顯著差別，四組細胞接種密度條件下，葡萄糖濃度在培養(yǎng)結(jié)束時分別為5.63、5.99、3.23和1.88 mmol/L（圖6-A）。氨均未大量生成，培養(yǎng)結(jié)束時分別為2.99、4.02、3.67和2.93 mmol/L（圖6-C）。而副產(chǎn)物乳酸在培養(yǎng)過程中持續(xù)累積，培養(yǎng)結(jié)束時分別為13.8、18.0、20.7和20.9 mmol/L（圖6-B）。從圖6-D可以看出，10×105cells/mL時，乳酸對葡萄糖的得率最低；而當細胞接種密度為3×105cells/mL時，乳酸對葡萄糖的得率最高。

2.4 灌注體系培養(yǎng)過程中ST細胞生長與代謝

如圖7所示，使用LSM進行ST細胞灌注體系培養(yǎng)，在第4天（第一次換液）后，葡萄糖濃度在28.25-35.35 mmol/L的范圍內(nèi)波動，培養(yǎng)結(jié)束時濃度為25.52 mmol/L，代謝副產(chǎn)物氨的濃度在2.56-3.72mmol/L的范圍內(nèi)穩(wěn)定波動，培養(yǎng)結(jié)束時濃度為3.02 mmol/L。但代謝副產(chǎn)物乳酸的濃度呈現(xiàn)持續(xù)上升的現(xiàn)象，培養(yǎng)結(jié)束時乳酸濃度為25.00 mmol/L，對應(yīng)的pH值也呈現(xiàn)持續(xù)下降的現(xiàn)象，培養(yǎng)結(jié)束時pH值6.87。如圖8所示，以2、4、6、9、12和15 μL 26.8×105cells/mL細胞懸液DNA吸光值做標準曲線。灌注培養(yǎng)15 d ST細胞終密度為36.6×105cells/mL，擴增了13.6倍，經(jīng)過計算得到此時微載體利用率為24.4%。

圖7 LSM灌注培養(yǎng)體系ST細胞代謝

3 討論

從上述研究中我們發(fā)現(xiàn)，在1-7 g/L微載體用量范圍內(nèi)，使用DMEM培養(yǎng)基在攪拌瓶培養(yǎng)體系中接種相同密度的ST細胞，隨著微載體濃度的上升，最大細胞密度不升反降。在初始24 h內(nèi)細胞密度變化基本一致，說明并不是細胞貼附階段貼附率的差異導致高微載體濃度低細胞密度現(xiàn)象的發(fā)生，結(jié)合倒置顯微鏡下5 g/L微載體濃度細胞貼附情況，可以得到即使在提供了充足的微載體貼壁面積條件下，ST細胞仍不能以較高效率利用提供的貼附面積。這很有可能是在平均每個微載體接種細胞數(shù)較少的情況下，DMEM培養(yǎng)基不能較好地支持ST細胞在微載體上良好的延伸和增殖導致的。此時，1 g/L與5 g/L微載體濃度下能得到相對較高的細胞密度，相對1 g/L微載體75.5%的利用率，5 g/L微載體利用率僅為13.7%，過多微載體的使用并沒有顯著增加細胞密度反而大大增加了成本。何錫忠等［20］對PK-15細胞攪拌瓶培養(yǎng)的研究同樣發(fā)現(xiàn)，微載體濃度與PK-15細胞密度僅有一定程度的相關(guān)性，高濃度微載體的表面積并沒有被充分利用。

使用LSM培養(yǎng)基，攪拌瓶體系中最大細胞密度隨著微載體濃度的上升而上升，且出現(xiàn)時間也隨之推遲。1 g/L微載體用量的實驗組在達到最大細胞密度后存在為期5 d的平臺期，結(jié)合該條件下倒置顯微鏡可以看出是貼附面積有限導致的。此時，3 g/L是較為理想的濃度，既能提供充足的貼壁面積，又能保持44.4%的微載體利用率，最大細胞密度可以達到29.3×105cells/mL。在此基礎(chǔ)上進一步考察優(yōu)化細胞接種密度，提高細胞接種密度可以增加最大細胞密度，選擇10×105cells/mL接種，最大細胞密度達到37.9×105cells/mL，擴增了2.88倍，微載體利用率達到57.4%，并且存在一個維持5 d的平臺期，代謝副產(chǎn)物積累對培養(yǎng)環(huán)境造成壓力較小，這對于我們最終生產(chǎn)豬瘟病毒的目的是有利的。但需要注意的是，在DMEM培養(yǎng)基中，高密度接種雖然減少了達到最大細胞密度的時間，但最大細胞密度并沒有顯著增加，并且也不能較好維持細胞密度，此時不能盲目增加接種密度。有很多研究得到細胞與微載體的最優(yōu)接種比［16，20］，如PK-15細胞以10-15 cells/MC接種時生長狀態(tài)最優(yōu)。我們的結(jié)論進一步證明微載體的用量與接種密度仍需要根據(jù)細胞在不同培養(yǎng)基中增殖延伸能力的差異設(shè)置更為合理的范圍。

最終，使用LSM培養(yǎng)基在灌注培養(yǎng)體系中培養(yǎng)ST細胞，細胞密度達到36.6×105cells/mL，擴增了14.6倍，F(xiàn)ibraCel disk微載體利用率為24.4%，與使用Cytodex 1攪拌瓶培養(yǎng)體系有一定差距，為期3 d的換液間隔導致大量乳酸的累積可能是其原因。后續(xù)實驗擬減少換液時間，提高細胞接種密度，保持培養(yǎng)過程中低濃度乳酸含量，以期在灌注培養(yǎng)體系得到高細胞密度并提高微載體利用率。

圖8 灌注系統(tǒng)DNA含量Hoechst檢測

4 結(jié)論

本研究使用DMEM補加10%FBS與LSM兩種培養(yǎng)基，通過考察微載體濃度與細胞接種密度對攪拌瓶培養(yǎng)體系中ST細胞增殖維持能力的影響，提高了微載體利用率，優(yōu)化了細胞生長。進一步在灌注培養(yǎng)體系中初步實現(xiàn)了ST細胞片狀微載體培養(yǎng)。

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（責任編輯 李楠）

The Effects of Microcarrier Concentration and Cell Density on the Growth of Swine Testicle Cells

CHEN Yi-heng TAO Shu-yu LIU Xu-ping TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

This study is to select the suitable microcarrier concentration and cell seeding density for enhancing the utilization of microcarrier，and optimize the adhered growth and m aintenance of ST（swine Testicle）cells. The effects of microcarrier concentration and seeding density on cell growth and maintenance were investigated using 2 different mediums：DMEM supplemented 10% serum or low serum medium（LSM）. Further，the utilizations of Cytodex 1 microcarrier by ST cells under different conditions were compared. Results were as below：continuous culture of ST cells in T150 flask using LSM lasted for 30 days，and the average specific growth rate was 0.626 d-1，which was 1.15 times of that using DMEM supplemented with 10% FBS. The maximum cell density was 38.3×10 cells/mL and the utilization was up to 58.8% when microcarrier concentration was 3 g/L Cytodex 1 in mixing bottle and seeding density was 10×105cells/mL. Furthermore，when cultured in perfusion system for 15 days，the final ST cell density reached 36.6×105cells/mL，which amplified 14.6 times. Conclusively，the uses of serum and microcarrier are favorable for ST cell adhesion and growth to achieve high cell density，but also this increases the cost of introducing microcarrier. Maximum utilization of microcarrier and nutrients in the medium，and the optimal growth and maintenance could be achieved through selecting suitable microcarrier concentration and seeding density. The results in this work provide guidance for further industrial-scale microcarrier culture system producing CSFV vaccine.

microcarrier；ST cells；classical swine fever virus；cell density

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.033

2015-10-19

國家自然科學基金項目（21206040，21406066），國家“863”計劃項目（2012AA02A303），國家重大專項（2013ZX10004003-003-003），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費（WF1214035）

陳以衡，男，碩士研究生，研究方向：動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)；E-mail：yihengchen91@126.com

劉旭平，男，博士，講師，研究方向：動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，E-mail：xupingliu@ecust.edu.cn；譚文松，男，博士，教授，研究方向：動物細胞培養(yǎng)與組織工程，E-mail：wstan@ecust.edu.cn