王海燕朱之軒金晶丁毅

（1. 新疆教育學院科學教育學院，烏魯木齊 830043；2. 武漢大學生命科學學院遺傳學系，武漢 430072）

蓮藕根尖染色體制片與免疫熒光染色技術(shù)的優(yōu)化

王海燕1，2朱之軒2金晶2丁毅2

（1. 新疆教育學院科學教育學院，烏魯木齊 830043；2. 武漢大學生命科學學院遺傳學系，武漢 430072）

在細胞遺傳學研究中，蓮藕根尖染色體制片比較困難，研究了蓮藕根尖染色體制片過程中適宜取材的根尖長度、有絲分裂指數(shù)、預(yù)處理試劑和處理時間、固定時間、酶解與低滲時間等相關(guān)因素，并對蓮制片進行了免疫熒光染色。結(jié)果表明：根尖長為1.5 cm左右時有絲分裂指數(shù)最高，預(yù)處理采用冰水冷凍處理24 h分裂相較多，染色體形態(tài)清晰；用4%多聚甲醛固定1h，染色體形態(tài)較好；采用2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶混合液37℃消化30 min，酶解較徹底，細胞質(zhì)殘留少，染色體分散良好；1×PBS低滲30 min，染色體形態(tài)較好；免疫熒光染色后經(jīng)檢測可觀察到較強的信號。

蓮藕根尖細胞；預(yù)處理；有絲分裂指數(shù)；染色體制片；DAPI染色；免疫熒光

蓮藕（Nelumbo nucifera）為蓮科蓮屬植物，主要分布在亞洲和大洋洲，也是我國最重要的一種水生經(jīng)濟作物，有食用、藥用和觀賞價值，也具園林造景和水體凈化等環(huán)境生態(tài)價值。經(jīng)過長期栽培馴化，已經(jīng)擁有上百個品種。隨著蓮藕基因組測序的完成［1，2］，蓮藕基因功能鑒定以及表觀遺傳學研究將成為蓮藕基因組研究的重點。免疫熒光染色技術(shù)是一種能快速、直觀、準確檢測目的抗原在細胞內(nèi)分布的生物技術(shù)，其原理是抗原與熒光素標記的抗體直接或間接特異性結(jié)合而在熒光顯微鏡下得以檢測［3］。該技術(shù)在醫(yī)學、動物學領(lǐng)域已應(yīng)用多年［4-9］，但在植物中的應(yīng)用報道較少。目前，有關(guān)蓮藕核型分析［10，11］和熒光原位雜交［12］的研究中提供了一些蓮藕的染色體制片方法，但蓮藕根尖染色體制片比較困難，運用常規(guī)方法制片難以得到效果滿意的染色體裝片，而且關(guān)于蓮藕根尖染色體制片新進展的報道也較少，不利于進行基因的染色體定位等細胞遺傳學研究。因此，本研究旨在探索出適用于蓮藕的染色體制片與免疫熒光染色的新技術(shù)，為蓮藕基 因進行染色體定位等細胞遺傳學及表觀遺傳學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蓮藕（Nelumbo nucifera）由武漢大學生命科學學院遺傳學系丁毅教授課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 選擇飽滿的蓮藕種子，在種皮上輕輕敲擊出小裂口（以利于種子萌發(fā)），清洗干凈后加入清水，置于28℃ 的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 取材及確定適宜的根長 約3周 后種子萌發(fā)長出初生根，當根尖分別生長至0.5、1.0、1.5和2.0 cm長度時，用清水清洗。選取長勢旺盛的根尖，進行下一步處理。

1.2.3 預(yù)處理 分別選擇8-羥基喹啉溶液、飽和對二氯苯溶液、飽和α-溴萘溶液、冰水作為預(yù)處理試劑，并進行制片效果比較。即分別用0.002 mol/L的8-羥基喹啉、飽和對二氯苯在16℃下浸沒材料進行預(yù)處理；飽和α-溴萘溶液在28℃培養(yǎng)箱中避光浸沒處理材料，并在2小時后換一次溶液。前3種預(yù)處理均設(shè)置4個預(yù)處理時間梯度：1、2、3和4 h；冰水冷凍處理時將材料置于冰水中，在4℃的冰箱中預(yù)處理18-24 h。

1.2.4 固定 將各種預(yù)處理后的材料取出，放置入1.5 mL EP管內(nèi)用無菌水沖洗數(shù)次，加入4%多聚甲醛沖洗3次，最后在管內(nèi)加入0.5 mL的4%多聚甲醛，4℃下固定，固定時間設(shè)置為4個梯度：30 min、1 h、1.5 h和2 h。

1.2.5 解離 固定后切取約長1 mm根尖用無菌水沖洗數(shù)次，用水解酶［2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶磷酸緩沖鹽溶液，（phosphate buffered saline，PBS）］于37℃下進行解離，時間設(shè)置為4個梯度：15、20、30和40 min。

1.2.6 低滲 先用 1×PBS洗數(shù)次，洗去酶液，再用1×PBS進行低滲，時間設(shè)置為4個梯度：15、20、30和40 min。壓片法制片，-80℃儲存。

1.2.7DAPI染色 從-80℃中取出裝片，迅速用刀片啟掉蓋玻片，在60℃烘箱內(nèi)烤片10 min。避光下，向載玻片上加15 μL DAPI（10 μg/mL）溶液，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下用紫外（UV）激發(fā)濾光片觀察鏡檢，進行分裂相及有絲分裂指數(shù)統(tǒng)計。

1.2.8 免疫熒光染色 從-80℃拿出裝片，于60℃烘箱中烤片1 h，加50 μL 3% BSA（Bovine Serum Albumin）溶液，加蓋玻片，37℃封阻1 h。揭去蓋玻片，將載玻片置于1×PBS溶液中清洗3次，每次5 min。 向載玻片上加入50 μL一抗稀釋液（用3%BSA以1∶500的比例稀釋一抗）。加蓋玻片，置于濕盒內(nèi)于4℃孵育過夜。揭去蓋玻片，將載玻片置于1×PBS溶液中清洗3次，每次5 min。避光條件下，向載玻片上加50 μL二抗稀釋液（用3%BSA以1∶100的比例稀釋二抗），加蓋玻片，于37℃孵育1 h。揭去蓋玻片，將載玻片置于1×PBS溶液中清洗3次，每次5 min。用去離子水清洗2次，每次3 min，仍然在避光條件下，室溫自然晾干。加15 μL DAPI（10 μg/mL）溶液，蓋上蓋玻片。

1.2.9 鏡檢 染色體裝片在Olympus BX60熒光顯微鏡下觀察，分別用紫外（UV）和綠色（WG）激發(fā)濾光片觀察DAPI染色和Cy3標記的信號，將好的圖片用Olympus DP80 CCD拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 不同根尖長度對制片的影響

根尖長度對細胞分裂指數(shù)有比較明顯的影響。由表1可見，當根尖長約1.5 cm時切取，效果最好，細胞分裂指數(shù)為11.63%。當根尖太短時，分裂相較少，染色體分散程度不好；根尖太長時，分裂相也較少。

2.2 不同預(yù)處理對制片的影響

在使用不同預(yù)處理試劑分別對根尖材料預(yù)處理后的結(jié)果是：4℃冰水浴預(yù)處理24 h細胞分裂相較多，染色體濃縮程度適宜，分散均勻，形態(tài)清晰，縊痕區(qū)明顯；0.002 mol/L的8-羥基喹啉溶液預(yù)處理2 h效果次之；而飽和對二氯苯溶液、飽和α-溴萘溶液在各個時間長度的預(yù)處理效果均不甚理想（表2，圖1，圖2）。

表1 蓮根尖長度對細胞分裂指數(shù)的影響

表2 幾種試劑在不同處理時間的效果比較

2.3 不同固定時間對制片的影響

固定時間對制片有一定影響。我們的實驗表明固定根尖1 h時間恰當，染色體形態(tài)較為清晰，如圖3-A；固定時間過短如30 min或過長超過1 h后，染色體形態(tài)均較為模糊（圖3-B）。3-B是固定2 h制片中的染色體，可見染色體形態(tài)較模糊。

2.4 不同酶解與低滲時間對制片的影響

在酶解去壁過程中，不同酶解與低滲時間的制片效果是不同的（圖4，表3）。用2.5%的混合酶液在 37℃酶解30 min酶解較徹底，能去除細胞壁和細胞膜，染色體分散較好（圖4-A）；低滲30 min染色

體形態(tài)清晰較好（圖4-B）；解離或低滲40 min或更長時，許多細胞脹破，多個細胞較多的染色體也會混在一起（圖4-C），細胞染色體也有丟失現(xiàn)象（圖4-D）。

圖1 不同預(yù)處理的制片效果

圖2 冰水預(yù)處理24 h的低倍鏡下制片效果

2.5 免疫熒光染色在染色體和細胞核上信號檢測

本實驗進行的免疫熒光染色中，使用的一抗是H3K27me2多克隆抗體，二抗是 熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG。

首先，用DAPI染色，觀察到染色體和細胞核都為藍色（圖5A、D），這是DAPI特有的顏色；再經(jīng)免疫熒光染色，在所觀察的圖像中，無論是細胞核還是染色體上均有較強的紅色陽性熒光信號（圖5-B、E），是Cy3熒光素特有的熒光信號。最后，將DAPI染色圖像與免疫熒光染色圖像進行重疊得到熒光染色信號圖像（圖5-C、F）。這表明本實驗進行的蓮藕染色體制片 及其免疫熒光染色是有效可行的。

圖3 不同固定時間的制片效果

圖4 不同酶解時間的制片效果

3 討論

3.1 制片過程的分析討論

有絲分裂指數(shù)=有絲分裂細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)×100%［13］。不同根尖長度對制片及有絲分裂指數(shù)是有影響的。當蓮藕根尖長約1.5 cm時切取，制片效果最好，有絲分裂指數(shù)最高。李玉璽［13］、鄭金雙等［14］研究中也有類似報道。

預(yù)處理可破壞和抑制紡錘體中微管的形成，使中期分裂相的數(shù)量增加，促使染色體濃縮變短，利于染色體分散［15］?？捎米黝A(yù)處理的藥物很多，如秋水仙素、對二氯苯、8-羥基喹啉、α-溴萘、冰水等［15，16］。不同植物進行預(yù)處理的最佳方式不同。楊玲等［15］利用對二氯苯-α-溴萘混合液預(yù)處理沙田柚根尖制片效果最好，中期分裂指數(shù)高；李艷輝等［17］用8-羥基喹啉處理皺葉酸模，染色體制片效果最好；任文娟等［18］、趙慶等［19］分別以冰水預(yù)處理菜用大黃、萬壽菊根尖，獲得的染色體中期細胞數(shù)比例最高，中期分裂相也較多；牛力濤等［20］、張健等［21］分別用8-羥基喹啉與秋水仙素混合液預(yù)處理裕民無刺紅花、木薯葉片，染色體制片的效果顯著。

表3 不同酶解時間的制片效果

固定劑可以中止細胞中的酶解反應(yīng)或其他代謝活動，防止抗原丟失或被破壞，并保持細胞原有的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。常用的固定劑有交聯(lián)劑和有機溶劑［3］。常規(guī)制片中常用的卡諾氏固定液是有機溶劑，其固定作用特點是穿透性強、可使細胞內(nèi)蛋白變性，但在染色過程中，處理時間過長時可導致抗原流失；多聚甲醛為交聯(lián)固定劑，能夠使細胞內(nèi)蛋白之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，能較好地保存抗原及組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，又能使蛋白質(zhì)得以固定［22-24］。解離可以除去細胞間的果膠層并軟化、破壞細胞壁［25］。Gill等［26］用纖維素酶和果膠酶溶解細胞壁。陳瑞陽等［27］提出了酶解去壁低滲的制片方法，制片的染色體分散較好、形態(tài)較平整。

圖5 免疫熒光染色的制片效果

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI是一種靈敏度高、特異性強的DNA 熒光染料，它對細胞核內(nèi)染色體、細胞質(zhì)DNA都有很好的熒光染色效果，DAPI 復合物發(fā)出的熒光為淺藍色，熒光顯微鏡觀察細胞標記的效率高，熒光穩(wěn)定，便于顯微照相，已得到廣泛應(yīng)用［28-30］。

3.2 制片過程各個步驟摸索、控制及優(yōu)化

我們在摸索最佳預(yù)處理方式時，保證了在整個制片過程中只有預(yù)處理是不同的變量，其余各個步驟中的同一個步驟都設(shè)置成相同方式。這樣材料經(jīng)過不同的預(yù)處理后，在相同的固定方式、解離方式、低滲方式、DAPI染色等方式處理后，鏡檢就可選出最適宜的預(yù)處理方式。本研究選出最適宜的預(yù)處理方式是冰水低溫處理方式。

本實驗采用間接免疫熒光測定法，即抗原與熒光素標記的抗體間接特異性結(jié)合，來檢測抗原蛋白在細胞核和染色體上的定位分布情況。與以往常規(guī)制片方法相比，DAPI 染色后裝片背景更為澄凈，在熒光顯微鏡下染色體更清晰，可清楚地觀察到中期或前中期染色體。免疫熒光染色后，在染色體和細胞核上可觀察到較強的陽性熒光信號。信號顯示了組蛋白H3K27me2二甲基化修飾后的位置，信號在著絲粒等異染色質(zhì)（heterochromatin）部位有明顯分布，這為組蛋白甲基化修飾的分布及功能研究奠定了基礎(chǔ)，也可以為如蓮藕一類染色體較小的植物的核型分析及染色體定位等細胞學研究奠定基礎(chǔ)。

以往免疫熒光研究多在人及動物體的組織細胞中進行，蓮藕根尖細胞的細胞壁等因素增加了免疫熒光技術(shù)在植物細胞中摸索運用的難度。本實驗為了克服卡諾氏固定液使細胞內(nèi)蛋白變性、可導致抗原流失等缺點，選擇多聚甲醛作為固定劑，因此能較好地保持抗原及組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)得以固定；而解離則選擇2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶混合酶液來溶解細胞壁，用1×PBS進行低滲，而不是使用在動物細胞免疫熒光染色中常用的通透劑TritonX-100）［8，22-24］。實驗結(jié)果表明，這樣處理后的蓮藕根尖染色體制片及免疫熒光染色效果較好。值得注意的是多聚甲醛本身的透膜作用較弱，不進行滲透，抗體很難進入細胞［24］，它在發(fā)揮交聯(lián)固定作用同時可能會阻礙抗體的滲透［23］，因此本實驗中也觀察到有些細胞核及核內(nèi)染色體上的熒光信號并不強。這需要我們對1×PBS的低滲作用等方面做進一步研究。而且，該技術(shù)對操作者技術(shù)要求較高，整個實驗流程較長，免疫染色中的抗體價格比較昂貴，需要操作者技術(shù)熟練。在蓮藕上篩選出來的最佳處理，還有待于運用于其他植物。

4 結(jié)論

本實驗對蓮藕根尖染色體進行了適于免疫熒光染色的染色體制片技術(shù)的研究和優(yōu)化，結(jié)果表明，根尖最適宜取材長度為1.5 cm左右，冰水預(yù)處理24 h分裂相較多，染色體形態(tài)清晰；用4%多聚甲醛固定1 h染色體形態(tài)較好；采用2.5%纖維素酶和2.5%果膠酶混合液37℃消化30 min，酶解較徹底；1×PBS低滲30 min，染色體形態(tài)較好；免疫熒光染色后呈現(xiàn)較強信號。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Optimization of Chromosome Preparation and
Immunofluorescence Staining for Root Tip of Nelumbo nucifera

WANG Hai-yan1，2ZHU Zhi-xuan2JIN Jing2DING Yi2
（1. College of Science Education，Xinjiang Education Institute，Urumqi 830043；2. Department of Genetics，College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072）

It is difficult to prepare lotus’s（Nelumbo nucifera）root tip chromosome in the cytogenetic study. Therefore，some related factors were studied，such as selecting the proper length of root tip，mitotic index，pretreatment medicament and time，the fixing time，the time of enzyme hydrolysis，and low osmosis in the chromosome preparation from the root tip cells of lotus，and then the immunofluorescence staining was also carried out to validate the chromosome preparation. The results showed that the mitotic index was the highest and morphology was clear when the root tips length was approximately 1.5 cm and the root tips was treated with ice water for 24 hours. The chromosome morphology was solid while root tips was for 1 h fixing with 4% paraformaldehyde. The enzyme hydrolysis was complete，the residue of cytoplasm was little，and the chromosome scattered well while the tips were digesting 30 min with combination of 2.5% cellulase and 2.5% pectinase at 37℃. The chromosome morphology was fine under 30 min low osmosis treatment by 1×PBS. Strong signals were detected after the immunofluorescence staining. This study set up the foundation for the relevant researches on cytogenetic and epigenetic studies of N. nucifera.

root tip cells of Nelumbo nucifera；pretreatment；mitotic index；chromosome preparations；DAPI staining；immunofluorescence

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.009

2015-06-01

國家自然科學基金資助項目（31271310）

王海燕，女，副教授，研究方向：植物遺傳學；E-mail：wanghaiyan8589@163.com