王鵬亭，趙宗杰，，周榮靈，張向陽，謝海濤，*（.深圳市仁泰生物科技有限公司，廣東深圳58047；.香港中醫(yī)科學院，香港999077）

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3，5-二硝基水楊酸法測定樟芝中多糖的含量

王鵬亭1，趙宗杰1，2，周榮靈2，張向陽2，謝海濤1，*
（1.深圳市仁泰生物科技有限公司，廣東深圳518047；2.香港中醫(yī)科學院，香港999077）

摘要：建立樟芝粗多糖的含量測定方法。以葡萄糖為對照品，采用3，5-二硝基水楊酸比色法，測定樟芝中還原糖和總糖的含量，并計算出總多糖的含量。研究結果表明多糖含量在0.25 mg/mL～1.00 mg/mL范圍內標準曲線具有良好的線性關系，測得回歸方程y=0.5979x-0.0378（R2=0.9996）。還原糖和總糖的平均加樣回收率分別為101.65%（RSD=1.89%）和100.92%（RSD=2.45%）。樟芝中總多糖含量為129.5mg/g～148.1mg/g。本方法靈敏、穩(wěn)定、重復性好，有助于樟芝質量控制方法的研究。

關鍵詞：樟芝；多糖；3，5-二硝基水楊酸比色法

樟芝（Antrodia cinnamonea）為原產于臺灣的珍貴藥用真菌［1］，樟芝含有多種生物活性物質，具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)、解毒、抗炎等功效［2-4］，有很高的藥用價值，因其子實體的生長只依賴于臺灣保護樹種——牛樟樹，故野生采集的樟芝數量遠不能滿足人們對樟芝的需求，從而限制了其發(fā)展，近年來，樟芝深層液體發(fā)酵的研究進展迅速［5］，逐漸成為國內外研究和開發(fā)的熱點。

樟芝的生理活性物質以多糖類和三萜類化合物為主［6-7］。多糖類一般的測定方法是運用苯酚-濃硫酸法、蒽酮-硫酸法和3，5-二硝基水楊酸比色法（簡稱DNS法）［8-10］。比色法中，前兩種方法只能測定總糖含量而不能分別測出單糖與多糖的含量。與之相比，DNS法的特點是在偏堿性條件下可以分別與初始還原糖及多糖水解后的總還原糖發(fā)生顯色反應，故可以準確測定初始還原糖與總還原糖的含量從而計算出多糖類成分的含量［11］。目前為止，鮮見關于采用DNS法測定樟芝中多糖含量的文獻報道。本研究首次建立DNS法測定樟芝中水溶性多糖的含量，并做了相應的方法學考察研究。

1　材料與儀器

1.1儀器

BSA224S分析天平：賽多利斯；H2050R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀；HWS24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用。

1.2試劑與材料

DNS試劑的配制：將6.3 g DNS和2 mol/L氫氧化鈉溶液262 mL加到500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，加5 g重蒸苯酚和5 g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后移入1 000 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，混勻，貯于棕色瓶中，于暗處放置7 d后使用。

1 mg/mL葡萄糖標準溶液：精密稱取在105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水使溶解，定容至刻度，搖勻備用。

材料：樟芝菌絲體（深圳市仁泰生物科技有限公司發(fā)酵所得），使用前50℃～60℃烘至恒重，粉碎至粉末，置干燥器中備用。

1.3方法

1.3.1DNS法的原理［11］

DNS法的原理是3，5-二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內，還原糖的量和反應液的顏色呈正比。

1.3.2檢測波長的確定

精密量取葡萄糖標準溶液和蒸餾水各1.0 mL，分別加入到25 mL具塞試管中，各加入DNS試劑2 mL，混合均勻后沸水浴加熱5min，迅速流水冷卻，加水定容至25mL，將葡萄糖顯色液+蒸餾水（空白）、DNS試劑+蒸餾水（空白）、葡萄糖顯色液+DNS試劑（空白）3組溶液分別在波長為360 nm～600 nm范圍內進行掃描。

1.3.3顯色劑用量的確定

精密量取1 mL葡萄糖標準溶液分別加入到編號為1～7的25 mL具塞試管中，補水至2 mL，分別加入1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值。

1.3.4顯色時間的確定

精密量取1 mL葡萄糖標準液分別加入到編號為1～9的25 mL具塞試管中，補水至2 mL，各加入2 mL DNS試劑，分別在沸水浴中加熱2、3、4、5、6、7、8、10、12、15、20 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值。

1.3.5標準曲線繪制

精密量取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于25 mL具塞試管中，補水至2 mL，加入DNS試劑2 mL，混合均勻后，沸水浴5 min，迅速流水冷卻，加水至刻度線。空白調零，以葡萄糖含量為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.6供試品溶液的制備

精密稱取樟芝菌絲體粉2.0 g，置250 mL蒸餾瓶中，加蒸餾水60 mL，90℃熱水浸提2 h，4 000 r/min離心10 min，取上清，加入200 mL 95%乙醇，充分振搖混勻，置冰箱中冷藏放置過夜。將冷藏過夜后的溶液移至離心管中4 000 r/min離心10 min，殘渣用95%乙醇洗滌3次，每次20 mL。將酒精洗滌后的殘渣用蒸餾水溶解，移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，備用。

1.3.7還原糖供試品溶液的制備

按1.3.6方法制備，即得牛樟芝菌絲體還原糖供試品溶液。

1.3.8總糖供試品溶液的制備

精密量取步驟1.3.6所制備的供試品溶液10 mL，置錐形瓶中，加10 mL 6 mol/L HCl溶液，封口，于沸水浴中加熱30 min，流水冷卻至室溫，加一滴酚酞指示劑，用6 mol/L NaOH溶液滴定至溶液初呈淡紅色，將溶液移入50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得牛樟芝菌絲體總糖供試品溶液。

1.3.9樣品測定

精密量取步驟1.3.7和1.3.8所制備的還原糖、總糖供試品溶液各2 mL，分別置于25 mL的具塞試管中，將對照組補水至2 mL，各加入DNS試劑2 mL，混合均勻后，沸水浴5 min，迅速流水冷卻，加水至刻度，搖勻，按照分光光度法［2005年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄VA］在540 nm波長處分別測定吸光度值，計算出樣品中總糖及還原糖的質量。按下式計算樣品中多糖的百分含量（用0.9的系數校正）［12］。

2　結果與分析

2.1檢測波長的選擇

關于DNS法測定波長的選擇一直存在著爭論，眾多文獻選定的最佳波長及其確定依據也各不相同，為了確定DNS法在測定牛樟芝多糖過程中的最佳波長，將相關因素進行波譜掃描結果見圖1。

由圖1中葡萄糖顯色液+DNS試劑曲線可以看出，最大吸光度值處的波長為490 nm，為了提高檢測靈敏度，通常情況下應該選擇吸光度值最大處的波長，但是由于DNS試劑在490 nm處有較大的吸收，且顯色期間由于部分DNS試劑與待測液中還原糖相結合，消耗了部分DNS試劑，從而造成測定吸光度時，作為空白參照的溶液中DNS試劑含量大于葡萄糖顯色液中DNS試劑含量，致使檢測結果比真實值偏低，因此檢測波長不選490 nm。所以最大吸收波長并非最佳工作波長，根據“吸收最大，干擾最小”原則從圖1還可以看出，DNS顯色劑+蒸餾水在波長≤520 nm時，都有一定的吸光度值，而在530 nm以后，DNS試劑+蒸餾水的吸光值接近于0，故本試驗最終確定的測定波長選為540 nm。

圖1　葡萄糖溶液吸收光譜圖Fig.1 The absorption spectrum with glucose solution

2.2顯色劑用量的確定

DNS顯色劑用量的確定應在不影響吸光度值的前提下取最小體積為最優(yōu)選，取不同體積DNS顯色劑進行試驗結果見圖2。

圖2　不同顯色劑用量的吸光度值Fig.2 The absorption determination with different DNS dosage

由圖2可以看出，當DNS顯色劑用量在2 mL以內時，隨著DNS試劑用量的增加，吸光度值增大，且浮動較大，當DNS用量在2 mL～5 mL時，吸光度值比較穩(wěn)，增長緩慢，浮動較小。因此，為了減小DNS試劑對吸光度值測定的影響，DNS試劑的用量不應該小于2.0 mL，故本試驗DNS試劑用量選擇2.0 mL。

2.3顯色時間的確定

最佳顯色時間的確定，應在滿足吸光度值處于穩(wěn)定期后最短用時為最優(yōu)選，這樣既可以提高檢測效率又可以降低能耗，取不同加熱時間進行試驗結果見圖3。

圖3　不同沸水浴加熱時間的吸光度值Fig.3 The absorption determination with different boiling water bath time

由圖3可以明顯看出，當沸水浴加熱時間在5 min內時，隨著水浴時間的增長，吸光度值增大。當沸水浴加熱時間增加到5 min后，吸光度值變化趨于穩(wěn)定，說明顯色反應在沸水浴加熱5 min時既已全部完成，故選擇5 min作為最佳顯色反應時間。

2.4標準曲線的制備

用葡萄糖標準溶液制備標準曲線，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線，結果見圖4。

圖4　葡萄糖標準曲線Fig.4 The standard curve of glucose

從圖4中可以看出，葡萄糖的含量和相應的吸光度值之間有一定的線性關系，其回歸方程為：y=0.597 9x-0.037 8，R2=0.999 6，線性關系良好。為了提高反應的顯色靈敏度和穩(wěn)定性，DNS顯色劑中加有酒石酸鉀鈉，但酒石酸鉀鈉卻減弱了亞硫酸鈉對還原糖的保護作用，從而造成部分葡萄糖的破壞而不顯色，故當葡萄糖濃度≤0.2 mg/mL時，其吸光度值要低于真實數值。該標準曲線表明，葡萄糖濃度在0.25 mg/mL～1.00 mg/mL之間顯色靈敏、穩(wěn)定且線性良好。

2.5方法學考察

2.5.1精確度試驗

取同一組還原糖供試品溶液連續(xù)測定10次，其吸光度值分別為0.172、0.172、0.173、0.172、0.174、0.173、0.173、0.174、0.172、0.173，其數值相對標準偏差RSD= 0.456%，說明儀器精確度良好。

取同一組總糖供試品溶液連續(xù)測定10次，其吸光度值分別為0.772、0.772、0.775、0.773、0.772、0.773、0.773、0.773、0.774、0.773，其數值相對標準偏差RSD= 0.122%，說明儀器精確度良好。

2.5.2重復性試驗

取同一批樣品5份，按1.3.7制備還原糖供試品溶液，依法測定，計算還原糖含量分別為0.96%、0.88%、 0.92%、0.93%、0.92%，還原糖平均含量為0.92%，RSD＝3.11%（n＝5），說明本方法測定還原糖的重復性好。

取同一批樣品5份，按1.3.8制備總糖供試品溶液，依法測定，計算總糖含量分別為15.70%、16.85%、16.12%、15.96%、16.43%，總糖平均含量為16.21%，RSD＝2.74%（n＝5），說明本方法測定總糖的重復性好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗

分別精密量取還原糖、總糖供試品溶液2 mL，按樣品測定方法測定，顯色反應完成后0～2 h內每隔10 min測定1次，結果見表1。

表1　穩(wěn)定性試驗結果Table 1 The results of the stability test

由表1可知，還原糖及總糖供試品在0～2 h內吸光度值基本穩(wěn)定不變，說明還原糖、總糖供試品溶液經顯色反應后在2 h內都是穩(wěn)定的。

2.5.4加樣回收率試驗

5批樟芝菌絲體粉樣品各取一份，每份約2.0 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別取還原糖、總糖供試品溶液2 mL，分別準確加入無水葡萄糖對照品適量。分別測定各組樣品溶液加樣前后還原糖含量及總糖含量，計算回收率，見表2。

表2　樣品加樣回收率試驗結果Table 2 The results of recovery test（n=5）

由表2可知，還原糖供試液和總糖供試液的平均加樣回收率分別為101.65%和100.92%，它們的RSD分別為1.89%和2.45%。這說明，該方法中還原糖和總糖的回收性良好。

2.5.5樣品含量測定

5批樟芝菌絲體粉測定結果見表3。

表3　5批樟芝樣品含量測定結果Table 3 The results of 5 batches of AC sample content test

經5批樣品含量測定結果表明，樟芝菌絲體粉中多糖含量為129.5 mg/g～148.1 mg/g。5個批次的樟芝菌絲體為深圳市仁泰生物科技有限公司樟芝聯(lián)合實驗室發(fā)酵所得。

3　討論

通常選用苯酚-硫酸法或硫酸-蒽酮比色法進行總糖測定。由于這兩種方法只能測定樣品中的總糖含量，對多糖的純度要求較高，若樣品純化不徹底，單糖去除不完全，則會使測定結果偏高。而DNS法測定多糖含量可排除單糖帶來的誤差，目前為止，鮮見關于采用DNS法測定樟芝多糖含量的相關報道。本試驗為首次建立DNS法測定樟芝中水溶性多糖的含量，所建立的方法經方法學考察結果表明，具有重復性好、安全簡便、準確靈敏等特點。

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Determination of Polysaccharide in Antrodia cinnamonea by 3，5- Dinitrosalicylic Acid Colorimeitry

WANG Peng-ting1，ZHAO Zong-jie1，2，ZHOU Rong-ling2，ZHANG Xiang-yang2，XIE Hai-tao1，*
（1. Shenzhen Rentai Biological Technology Co.，Ltd，Shenzhen 518047，Guangdong，China；2. Hong Kong Chinese Medical Science Academy，Hongkong 999077，China）

Abstract：A method for the determination of polysaccharide in Antrodia cinnamonea（AC）was developed.To calculate the total polysaccharide content with the reducing sugar and total sugar content that was detemined by 3，5- dinitrosalicylic acid colorimeitry with glucose as the standard substance. The results showed that：The calibration curve of polysaccharide was in good linearity over the range of 0.25 mg/mL-1.00 mg/mL，the regression equation was y=0.597 9x-0.037 8（R2=0.999 6）.The average recovery of reducing sugar solution and total sugar solution in the test were 101.65%with RSD，1.89%and 100.92%with RSD，2.45%respectively.The polysaccharide content of AC was 129.5 mg/g-148.1 mg/g.The method which can be used for the quality control of AC is convenient，accurate and sensitive with good reproducibility.

Key words：Antrodia cinnamonea；polysaccharide；3，5-dinitrosalicylic acid colorimeitry

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.038

基金項目：深圳市戰(zhàn)略新興產業(yè)發(fā)展專項資金項目（CYZZ2013041 6170923767）

作者簡介：王鵬亭（1984—），男（漢），工程師，碩士，主要從事藥用真菌有效成分的提取及藥效學研究。

*通信作者：謝海濤，男（漢），碩士，主要從事樟芝的現(xiàn)代化研究。

收稿日期：2015-03-16