章銀良，盧慢慢，張陸燕（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

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魚肉蛋白- D-木糖MRPs抗氧化活性的研究

章銀良，盧慢慢，張陸燕
（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

摘要：為分析實(shí)際體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的抗氧化活性，采用4種不同品種魚肉（鰱魚、草魚、鯽魚和鯉魚）蛋白與D-木糖建立實(shí)際體系進(jìn)行美拉德反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物通過恒溫油浴加熱制備，以DPPH自由基（DPPH·）作為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定指標(biāo)。單因素試驗(yàn)考察加熱溫度、時(shí)間、pH及反應(yīng)底物質(zhì)量比對(duì)美拉德反應(yīng)的影響，優(yōu)化出MRPs抗氧化活性最強(qiáng)的鯽魚蛋白-D-木糖為實(shí)際反應(yīng)體系。均勻試驗(yàn)結(jié)果表明，鯽魚蛋白-D-木糖實(shí)際體系MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率最高，抗氧化活性最強(qiáng)。且最佳工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間70min，溫度136℃，初始pH 12.0及反應(yīng)底物質(zhì)量比（鯽魚蛋白∶D-木糖）為3∶1。

關(guān)鍵詞：美拉德反應(yīng)；實(shí)際體系；抗氧化活性；魚肉；D-木糖

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）又稱為非酶褐變反應(yīng)，主要是指在食品加工和儲(chǔ)存的過程中含氨基的化合物（蛋白質(zhì)、氨基酸及肽類）與含羰基化合物（還原糖）之間發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)［1］。美拉德反應(yīng)是加工食品的色澤和芳香風(fēng)味的重要來源，其反應(yīng)歷程可分為3個(gè)階段：初級(jí)階段，中級(jí)階段和高級(jí)階段。初級(jí)階段主要進(jìn)行羰氨的縮合及分子重排，生成不揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體成分；中級(jí)階段主要發(fā)生3個(gè)途徑，分別是在酸性、堿性和高溫下進(jìn)行，生成醛類和酮類等物質(zhì)；高級(jí)階段主要發(fā)生醇醛的縮合及生成類黑精物質(zhì)的聚合反應(yīng)［2-3］。影響美拉德反應(yīng)的因素有很多，如氨基酸及糖的種類和性質(zhì)、水分活度、加熱時(shí)間、加熱溫度、反應(yīng)pH、反應(yīng)底物質(zhì)量比、金屬離子及緩沖液濃度等［4-6］。美拉德反應(yīng)最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或稱擬黑素［7］。MRPs具有多種多樣的生物活性如抗氧化［8］、抗誘變［9］、抗增殖［10］等，尤其是類黑精素、還原酮及一些含N、S的雜環(huán)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，甚至可與常用的食品抗氧化劑BHA、BHT相媲美［11］。

對(duì)于美拉德反應(yīng)的研究較多集中在模式體系而對(duì)實(shí)際體系的研究較少，本文以魚肉蛋白-D-木糖建立實(shí)際體系進(jìn)行美拉德反應(yīng)并制備其產(chǎn)物，以DPPH自由基（DPPH·）作為反應(yīng)抗氧化活性的測(cè)定指標(biāo)，選出最佳魚肉蛋白-D-木糖實(shí)際體系組合，并優(yōu)化出最佳工藝條件，為后期研究不同加工技術(shù)、不同反應(yīng)溶劑對(duì)實(shí)際體系美拉德反應(yīng)的影響打下良好的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

魚為鰱魚（蛋白含量18.6%）、草魚（蛋白含量16%）、鯽魚（蛋白含量13%）、鯉魚（蛋白含量20%）：河南鄭州高新區(qū)蓮花市場(chǎng)；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），分析純：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；無(wú)水乙醇、D-木糖等均為分析純：阿拉丁公司。

1.2主要儀器設(shè)備

HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽：鞏義市予華儀器有限公司；UV-2102pc紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平：奧豪斯（上海）儀器有限公司；pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3方法

1.3.1魚肉蛋白-D-木糖實(shí)際體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備參考章銀良［12］等文獻(xiàn)中的制備方法并做適當(dāng)修改。

首先是鮮魚材料的前處理，魚需進(jìn)行去頭、去皮、去刺等處理，然后將純魚肉進(jìn)行絞碎并換算成相應(yīng)魚蛋白含量的量待用。影響美拉德反應(yīng)的因素主要有加熱時(shí)間、加熱溫度、反應(yīng)初始pH和反應(yīng)底物質(zhì)量比，因此可按上述4個(gè)因素依次進(jìn)行單因素試驗(yàn)。制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的具體操作步驟如下：

1）溫度對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化能力的影響：準(zhǔn)確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質(zhì)量比1∶1）用去離子水進(jìn)行溶解后調(diào)pH為7.0，并定容至25 mL，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，密封嚴(yán)實(shí)后，將恒溫油浴鍋調(diào)至50℃進(jìn)行反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速將反應(yīng)液置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法依次在75、100、125、150、175℃條件下制備美拉德反應(yīng)液后進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

2）加熱時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化能力的影響：準(zhǔn)確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質(zhì)量比1∶1）用去離子水進(jìn)行溶解后調(diào)pH為7.0，并定容至25 mL，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，密封嚴(yán)實(shí)后，將恒溫油浴鍋調(diào)至125℃進(jìn)行反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法依次加熱60、90、120、150、180 min制備美拉德反應(yīng)液后進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

3）反應(yīng)初始pH組對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化能力的影響：準(zhǔn)確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質(zhì)量比1∶1）用去離子水進(jìn)行溶解后調(diào)pH為4.0，并定容至25 mL，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，密封嚴(yán)實(shí)后，將恒溫油浴鍋調(diào)至125℃進(jìn)行反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液依次調(diào)pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0制備美拉德反應(yīng)液后進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

4）反應(yīng)底物對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化能力的影響：準(zhǔn)確稱量鰱魚蛋白（鰱魚肉糜3.36 g）、草魚蛋白（草魚肉糜3.91 g）、鯽魚蛋白（鯽魚肉糜4.81 g）、鯉魚蛋白（鯉魚肉糜3.16 g）分別與D-木糖0.63 g（質(zhì)量比1∶1）用去離子水進(jìn)行溶解后調(diào)pH為7.0，并定容至25 mL，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，密封嚴(yán)實(shí)后，將恒溫油浴鍋調(diào)至125℃進(jìn)行反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速將反應(yīng)液置于冰水中冷卻、過濾、取濾液待用。并按上述方法依次稱量4種不同魚蛋白和D-木糖質(zhì)量比為1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5制備美拉德反應(yīng)液后進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

1.3.2DPPH自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)Yen G等［13］文獻(xiàn)中測(cè)定DPPH·清除能力的方法來評(píng)價(jià)MRPs的抗氧化活性，先配置0. 12 mmol/L的DPPH酒精溶液（最好現(xiàn)用現(xiàn)配），避光保存。取1 mL稀釋50倍后的樣品溶液，再加4 mL DPPH酒精溶液，搖勻，放在室溫條件下避光反應(yīng)30 min。然后用紫外可見分光光度計(jì)在517 nm的條件下測(cè)定其吸光度值，記為AS。以相同的方法取1 mL的去離子水代替稀釋后的樣品溶液作為控制組，在517 nm條件下測(cè)定其吸光度值，記為Ac。計(jì)算DPPH自由基清除率方程式如下所示：

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1不同加熱溫度對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

加熱溫度不僅影響著美拉德反應(yīng)的速度，而且對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的濃度及它們之間的相互作用也有一定的影響見圖1。

如圖1所示，在加熱初期，MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高增加緩慢。隨后則隨著加熱溫度的升高幾乎呈線性趨勢(shì)增加，在150℃時(shí)，4個(gè)組合的抗氧化活性均達(dá)到最強(qiáng)，可知MRPs中的抗氧化活性物質(zhì)在高溫條件下更有利于生成，其中鯽魚蛋白-D-木糖組合的清除率為17.98%，略高于其它3個(gè)組合。

圖1　不同加熱溫度下實(shí)際體系MRPs對(duì)DPPH自由基清除率的變化Fig.1 The change of different heating temperatures on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

2.1.2不同加熱時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

不同加熱時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響見圖2。

圖2　不同加熱時(shí)間下實(shí)際體系MRPs對(duì)DPPH自由基清除率的變化Fig.2 The change of different heating time on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由圖2可以看出，加熱時(shí)間對(duì)美拉德反應(yīng)抗氧化活性物質(zhì)的生成具有較強(qiáng)的影響力，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，4個(gè)組合MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率均顯著增強(qiáng)。

2.1.3不同反應(yīng)初始pH對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

不同反應(yīng)初始pH對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響見圖3。

圖3　不同反應(yīng)初始pH下實(shí)際體系MRPs對(duì)DPPH自由基清除率的變化Fig.3 The change of different reaction initial pH on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由圖3可知，酸性和堿性條件有利于美拉德反應(yīng)抗氧化活性物質(zhì)的生成，在pH7.0～12.0的范圍內(nèi)，MRPs的抗氧化活性逐漸增加，可能是由于隨著pH的增加，羰-氨反應(yīng)產(chǎn)生的吡嗪類物質(zhì)的種類和產(chǎn)量也增加。羰氨縮合后，糖通過反醇醛、烯醇化和脫水反應(yīng)進(jìn)行降解，這些反應(yīng)都具有堿催化作用。且4個(gè)組合均在pH 12.0時(shí)抗氧化活性達(dá)到最強(qiáng)，鯽魚蛋白-D-木糖最高為40.59%。

2.1.4不同底物質(zhì)量比對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

不同底物質(zhì)量比對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響見圖4。

圖4　不同反應(yīng)底物比例下實(shí)際體系MRPs對(duì)DPPH自由基清除率的變化Fig.4 The change of different reaction substrate ratio on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由圖4可知，底物質(zhì)量比對(duì)實(shí)際體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響表明，在魚肉蛋白質(zhì)含量與D-木糖比例小于1范圍內(nèi)，隨著魚肉含量的增加MRPs抗氧化活性顯著減?。辉隰~肉蛋白質(zhì)與D-木糖比例大于1范圍時(shí)，隨著魚肉含量的增加MRPs抗氧化活性增加顯著，當(dāng)魚肉蛋白與D-木糖的比例為3∶1時(shí)抗氧化活性達(dá)到最高。圖4還表明，在美拉德反應(yīng)中，底物中糖類與蛋白質(zhì)質(zhì)量相接近時(shí)，MRPs抗氧化活性最低，固定魚肉含量，隨著D-木糖含量的增加MRPs抗氧化活性緩慢升高。固定D-木糖含量，隨著魚肉蛋白質(zhì)含量增加MRPs抗氧化活性增加比D-木糖要快，由此可預(yù)見，魚肉蛋白相對(duì)于D-木糖而言，對(duì)實(shí)際體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成更具有關(guān)鍵性的作用。

2.2均勻試驗(yàn)

2.2.1均勻試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明鯽魚蛋白-D-木糖組合的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性均高于其它3個(gè)組合。因此，下一步進(jìn)行均勻試驗(yàn)優(yōu)化鯽魚蛋白-D-木糖組合優(yōu)化出反應(yīng)的最佳工藝條件。以DPPH自由基清除率為檢測(cè)指標(biāo)，采用U6*（64）［13］均勻試驗(yàn)表，因素水平表見表1。

表1　U6 *（64）均勻試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of U6*（64）uniform experiment

表2　均勻試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of uniform experiment

2.2.3軟件分析

采用Mathematics 4. 0軟件對(duì)均勻試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到結(jié)果見表3、表4。

表3　回歸參數(shù)表Table 3 Regression parameter table

表4　回歸方差分析表Table 4 Regression analysis of variance table

Mathematics 4.0軟件分析結(jié)果表明，反應(yīng)初始pH 對(duì)MRPs抗氧化活性具有極顯著影響，加熱時(shí)間和初始pH之間及加熱溫度和初始pH之間均具有交互作用，并對(duì)MRPs抗氧化活性的影響極顯著。影響MRPs抗氧化活性的主次順序依次為：pH（X3）＞時(shí)間（X1）＞溫度（X4）＞質(zhì)量比（X2）。

回歸方程：Y（自由基清除率）=35.721-1.44808X1X30.1+ 97.136 7X30.5-7.955 84×10-6X12X2-0.000 894 773X3X42。在測(cè)試條件范圍內(nèi)，經(jīng)過計(jì)算后的最佳優(yōu)化條件為：溫度136℃、反應(yīng)時(shí)間70 min、反映初始pH 12. 0、鰱魚蛋白與木糖質(zhì)量比3∶1，此時(shí)MRPs抗氧化活性最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的理論清除率為44.35%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證在此優(yōu)化條件下得到的MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率為43.29%，與理論值的相對(duì)誤差2.39%，超過各試驗(yàn)值。說明均勻試驗(yàn)優(yōu)化后的最優(yōu)條件組合制備的MRPs具有最強(qiáng)的抗氧化活性，優(yōu)化結(jié)果可靠。

3　討論與結(jié)論

以4種不同品種魚肉（鰱魚、草魚、鯽魚和鯉魚）與D-木糖進(jìn)行實(shí)際體系美拉德反應(yīng)，通過普通油浴加熱制備不同反應(yīng)條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以DPPH自由基（DPPH·）作為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)、探索加熱溫度、時(shí)間、pH及反應(yīng)底物質(zhì)量比對(duì)美拉德反應(yīng)的影響，并選出MRPs抗氧化活性最強(qiáng)的魚肉蛋白-D-木糖實(shí)際體系組合。由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)際體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化能力隨著反應(yīng)溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，反應(yīng)初始pH為12.0時(shí)MRPs的抗氧化活性最強(qiáng)，增加反應(yīng)底物魚蛋白的濃度則有利于提高M(jìn)RPs的抗氧化能力，且鯽魚蛋白-D-木糖組合對(duì)DPPH自由基（DPPH·）清除率最高，MRPs的抗氧化活性最強(qiáng)。對(duì)鯽魚蛋白-D-木糖進(jìn)行均勻試驗(yàn)優(yōu)化出最佳工藝條件。結(jié)果表明：最佳工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間70 min，溫度136℃，初始pH 12.0及反應(yīng)底物質(zhì)量比（鯽魚蛋白∶D-木糖）為3∶1。反應(yīng)初始pH對(duì)MRPs抗氧化活性具有極顯著影響，加熱時(shí)間和初始pH之間及加熱溫度和初始pH之間均具有交互作用，并對(duì)MRPs抗氧化活性的影響極顯著，經(jīng)由均勻試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件后所制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其抗氧化能力得到顯著提高，抗氧化能力最強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Yoo M A，Kim H W，Kim K H，et al.Antioxidant effect of brown substances separated from defatted roasted sesame dregs［J］.Food Science and Biotechnology，2004，13（3）：274-278

［2］付莉，李鐵剛.簡(jiǎn)述美拉德反應(yīng)［J］.食品科技，2006（12）：9-11

［3］Baynes J W，Thorpe S R. Role of oxidative stress indiabetic complications：a new perspective on an old paradigm［J］. 1999，48（3）：1-9

［4］張莎莎，陳善斌，強(qiáng)婉麗，等.醇對(duì)木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)體系顏色特征及抗氧化活性的影響［J］.食品工業(yè)科技，2013（23）：88-92

［5］Francisco J，Morales，Salvio Jimenez-Perez. Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence［J］. Food Chemistry，2001，72（1）：119-125

［6］Chawla S P，Chander R，Sharma A. Antioxidant properties of Maillard reaction products obtained by gamma-irradiation of whey proteins［J］. Food Chemistry，2009，116（1）：122-128

［7］賀湘，于淑娟，史文慧，等.脈沖電場(chǎng)強(qiáng)化天冬酰胺-果糖體系的研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（1）：78-81

［8］郭麗萍，王鳳舞，劉翠翠，等.木糖與甘氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能的研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（7）：79-81

［9］Wagner K H，Reichhold S，Koschutnig K，et al. The potential antimutagenic and antioxidant effects of Maillard reaction products used as “natural antibrowning”agents［J］. Molecular Nutrition and Food Research，2007，51（4）：496-504

［10］Hwang I G，Kim H Y，Woo K S，et al. Biological activities of Maillard reaction products（MRPs）in a sugar amino acid model system［J］. Food Chemistry，2011，126（1）：221-227

［11］Lingnert H，Hall G. Formation of antioxidative Maillard reaction products during food processing，amino-carbonyl reactions in food and biological systems［M］. Tokyo：Elsevier，1986：273

［12］章銀良，周文權(quán).均勻試驗(yàn)優(yōu)化酪蛋白—木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性［J］.食品工業(yè)，2013，34（1）：27-30

［13］Yen G，Hsieh P. Antioxidative activity and scavenging effects on active oxygen of xylose-lysine Maillard reaction products［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，1995，67（3）：415-420

Study on Antioxidant Activities of Maillard Reaction Products Derived from Fish Protein-D-xylose

ZHANG Yin-liang，LU Man-man，ZHANG Lu-yan
（School of Food & Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，Henan，China）

Abstract：The purpose was to optimize the antioxidant activity of Maillard reaction products（MRPs）derived from four different varieties of fish protein silver carp，grass carp，crucian carp，carp and D-xylose actual system，the preparation of reaction producted by constant temperature oil bath heating and DPPH radical-scavenging activity was described as the antioxidant activity indicator.The temperature，retention time，pH and mass ratio were taken into consideration，selecting MRPs strongest antioxidant activity of fish protein-D-xylose actual system combination，the optimize conditions from uniform test. The optimal conditions were retention time 70 min，temperature 136℃，pH 12.0，mass ratio（crucian carp protein∶D-xylose）3∶1.

Key words：maillard reaction；actual system；antioxidant activity；fish；D-xylose

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.009

作者簡(jiǎn)介：章銀良（1963—），男（漢），教授，博士，主要研究方向：食品科學(xué)與質(zhì)量安全。

收稿日期：2015-03-10