邱斌，付博菲，2，徐同成，孫文佳，杜方嶺，*（．山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南25000；2.天津師范大學(xué)，天津300387）

?

復(fù)合蛋白酶提高谷朊粉溶解度的研究

邱斌1，付博菲1，2，徐同成1，孫文佳1，杜方嶺1，*
（1．山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南250100；2.天津師范大學(xué)，天津300387）

摘要：利用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別水解谷朊粉，發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶水解谷朊粉水解度較大，水解后分子量較小，且后續(xù)蛋白回收率較大，因此選用復(fù)合蛋白酶作為后續(xù)谷朊粉改性用酶。

關(guān)鍵詞：谷朊粉；溶解度；蛋白酶；篩選

目前常用于水解蛋白的蛋白酶主要類型有：1、動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶；2、植物來(lái)源的蛋白酶，如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶；3、微生物來(lái)源的蛋白酶，如枯草芽孢桿菌、青霉、曲霉中產(chǎn)生的酶。不同類型的酶對(duì)水解谷朊粉的能力不同，從而對(duì)后續(xù)提高其乳化性能的能力也不同，因此本研究主要探究不同酶水解谷朊粉的程度，從常用的水解酶中篩選出一種較優(yōu)的，對(duì)探究酶法改性谷朊粉提高其溶解性是很有必要的。

1　材料與方法

1.1原料與試劑

市售谷朊粉：泰裕麥業(yè)有限公司；中性蛋白酶：Solarbio公司；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶：Solarbio公司；牛血清蛋白：生工生物。

1.2試驗(yàn)儀器

pH211酸度計(jì)：HANNA instrument；T25勻漿機(jī)：德國(guó)IKA公司；79-1磁力攪拌器：金壇市鴻科儀器廠；pk-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CR22D高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；UV160紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3方法

1.3.1谷朊粉基本組成測(cè)定

水分測(cè)定：105℃烘箱法，GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。

粗蛋白測(cè)定：微量凱氏定氮法GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，蛋白系數(shù)為5.7。

1.3.2不同蛋白酶水解谷朊粉

5種不同的蛋白酶分別水解谷朊粉，最優(yōu)水解反應(yīng)條件見表1。將谷朊粉配置成5%的溶液，加入按酶活一定加入一定量的蛋白酶，設(shè)定測(cè)定水解度的時(shí)間段，按照預(yù)定的時(shí)間測(cè)定水解度，達(dá)到預(yù)定的最長(zhǎng)時(shí)間時(shí)停止調(diào)節(jié)pH，將溶液置于98℃的水浴中加熱10 min滅酶后，冷凍干燥備用［1］。

表1　不同蛋白酶水解谷朊粉的最優(yōu)條件Table 1 Conditions for the hydrolysis of wheat gluten with different proteases

1.3.3中堿性條件水解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)水解度（DH），是指蛋白質(zhì)水解反應(yīng)過(guò)程中單位質(zhì)量中肽鍵斷裂數(shù)占總數(shù)的比例。中堿性條件下通常采用pH-Stat法，計(jì)算公式如下［2］：

式中：V為NaOH溶液消耗體積，mL；N為NaOH溶液濃度，mol/L；M為谷朊粉質(zhì)量，g；H為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)（毫克當(dāng)量/每克蛋白質(zhì)），谷朊粉取值8.38；T為溫度，℃；α為氨基的平均解離度；pH為水解溶液的pH值；pKa為α-氨基的解離度的負(fù)對(duì)數(shù)。

1.3.4蛋白回收率測(cè)定

蛋白質(zhì)回收率測(cè)定參考Fonkwe等［3］，蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法參考1.3.1。

1.3.5可溶性蛋白的測(cè)定

測(cè)定谷朊粉溶解度采用雙縮脲法［4］：

配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：將標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（BSA）配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，后用濃度為1 mg/mL BSA溶液的A280為0.66來(lái)矯正。

雙縮脲試劑：稱取1.50 g硫酸銅和6.0 g石酸鉀鈉，溶解于500 mL水中，不斷攪拌，并加入300 mL 10% NaOH溶液，最終用水定容至1 000 mL后貯存于塑料瓶或內(nèi)壁涂有石蠟的瓶中。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液20 mL，分別吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，用蒸餾水補(bǔ)足到1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑于540 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。把待測(cè)蛋白的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到待測(cè)蛋白的溶解度值。蛋白質(zhì)溶解度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 6。

圖1　牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

1.3.6谷朊粉溶解性測(cè)定

采用分散系數(shù)表示［5］：

式中：C為被測(cè)蛋白質(zhì)的濃度，參照2.3.5，mg/mL；V為被測(cè)蛋白質(zhì)溶液的總體積，mL；W為蛋白質(zhì)樣品的總質(zhì)量，mg。

1.3.7谷朊粉水解物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

一般情況下SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進(jìn)行，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物在兩極間電流接通后，被凝膠中形成的移動(dòng)界面帶動(dòng)前進(jìn)。本試驗(yàn)參照Laemmli方法［6］加以改進(jìn)：

電泳緩沖液：125 mmol/L Tris 1.25 mol/L甘氨酸（電泳級(jí)）0.5%（m/v）電泳級(jí)SDS

可配制成5×貯存液，在900 mL去離子水中溶解15.1 g Tris和94 g甘氨酸，然后加入50 mL 10%（m/V）電泳級(jí)SDS的貯存液，用去離子水補(bǔ)至1 000 mL即可。

2×SDS凝膠上樣緩沖液：1 mL 1mol/L Tris-HCl （pH6.8）+ 4 mL 10%SDS + 2 mL 1%溴酚藍(lán)+ 2 mL甘油+ 1 mL去離子水。

分離膠和濃縮膠：分別配制20 mL分離膠、10 mL濃縮膠。分離膠和濃縮膠的組成見表2。

表2　分離膠和濃縮膠的組成Table 2 The constitutes of separation and stacking gel

點(diǎn)樣完成之后，向兩側(cè)電泳槽中加入電極緩沖液，連通電源，啟動(dòng)機(jī)器。在電泳槽兩端分別接上正負(fù)兩極，初始電壓80 V，電流20 mA，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電流控制在10 mA，電壓控制在110 V。電泳過(guò)程中維持強(qiáng)度恒定，以樣品到達(dá)全膠長(zhǎng)的四分之三為止。

2　結(jié)果與討論

2.1谷朊粉基本組成

測(cè)得原料谷朊粉的含水量是5.6%，粗蛋白含量是81.9%。

2.2不同蛋白酶水解谷朊粉水解度與時(shí)間的關(guān)系

控制蛋白質(zhì)水解反應(yīng)與蛋白質(zhì)水解反應(yīng)機(jī)理有關(guān)，包括可溶性酶和不可溶性酶作用底物［1］。如圖2所示。

圖2　不同蛋白酶水解谷朊粉水解度與時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Enzymatic hydrolysis of wheat gluten with different proteases

風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別水解谷朊粉，水解度變化趨勢(shì)是先快后慢，最終保持穩(wěn)定，不同蛋白酶達(dá)到最大水解度的時(shí)間不同。其中復(fù)合蛋白酶能夠使谷朊粉水解到較大程度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶次之，胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶相對(duì)較水解谷朊粉能力較弱。這可能是由于谷朊粉蛋白中各種氨基酸含量不同，不同蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，使得酶切切點(diǎn)數(shù)量不同，影響水解作用的速度；隨著反應(yīng)進(jìn)行，蛋白酶酶活力逐漸降低，導(dǎo)致蛋白酶水解能力逐漸減弱。

2.3不同水解度對(duì)谷朊粉水解物溶解性的影響

不同程度的水解度會(huì)導(dǎo)致水解物的溶解性不同，通過(guò)對(duì)5種酶在不同水解度梯度時(shí)溶解性的測(cè)定，如圖3所示。

不同酶水解物到達(dá)最大溶解度的水解度不同，其中復(fù)合蛋白酶在水解度大概在12%時(shí)得到最大溶解度；堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶到達(dá)最大溶解度的水解度也在12%左右，但較復(fù)合蛋白酶水解物的溶解度小；胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解后溶解度在水解度為4%左右時(shí)最大，但最大值較小。因此能夠得出在水解度為0%～12%時(shí)，水解物溶解度隨水解度增大而逐漸增大。

圖3　不同水解度對(duì)谷朊粉水解物溶解性的影響Fig.3 The effect of different hydrolysis for the solubility profile of the wheat gluten hydrolysate

2.4谷朊粉水解物的溶解度

谷朊粉在中性條件下溶解度很差，但通過(guò)調(diào)節(jié)pH能夠改善其溶解性。經(jīng)不同酶水解后，在一定的pH范圍內(nèi)的溶解度變化不大，如圖4所示。

圖4　pH對(duì)酶解前后谷朊粉溶解度的影響Fig.4 Effect of pH on solubility profiles of WGHs and hydrolysate with different enzymes

這可能是由于酶解過(guò)程中產(chǎn)生了更多的具有親水作用的小分子多肽，因此即使在pH到達(dá)等電點(diǎn)時(shí)，也對(duì)其無(wú)太大影響。

2.5谷朊粉水解物的蛋白回收率

不同蛋白酶水解谷朊粉后得到的蛋白質(zhì)含量見表3。

表3　谷朊粉不同蛋白酶水解物的蛋白回收率Table 3 Protein recovery from different protease hydrolysate of wheat gluten

蛋白質(zhì)回收率是一項(xiàng)非常重要的測(cè)定指標(biāo)，它能夠用于設(shè)計(jì)生產(chǎn)水解食用蛋白質(zhì)的加工工藝中。影響蛋白回收率的因素有很多，其中影響作用最大的是蛋白酶使用的種類。復(fù)合蛋白酶水解谷朊粉得到的高回收率和低使用量為后續(xù)投入到規(guī)?；a(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.6電泳分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳由連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)構(gòu)成，即分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)。在電泳過(guò)程中，樣品首先從濃縮膠中通過(guò)，由于等速電泳現(xiàn)象在進(jìn)入分離膠前就被濃縮。進(jìn)入分離膠后，聚丙烯酰胺根據(jù)分子大小進(jìn)行篩濾，小分子蛋白阻力小，很容易通過(guò)凝膠孔徑，遷移速度快；大分子蛋白受到阻力較大而被滯后，最終在電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)能夠根據(jù)各自分子量的大小而被分離。

為了探究不同蛋白酶對(duì)谷朊粉水解作用的影響，使用SDS-PAGE法分別得到不同蛋白酶水解產(chǎn)物的分子量。結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同蛋白酶水解產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE profile of WGHs obtained with different enzymes

從b泳道中能夠看出復(fù)合蛋白酶水解物分子量大部分都在14.4 kDa一下；c和d泳道中水解物分子量還有部分集中在20.1 kDa～31.0 kDa，其余也在14.4kDa以下；e泳道中水解物分子量在43.0 kDa～14.4 kDa及 14.4 kDa以下均與分布；f泳道中水解物分子量主要集中在97.4 kDa～20.1 kDa。表明復(fù)合蛋白酶水解的較為充分，水解能力較優(yōu)。

3　結(jié)論

1）分別采用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)谷朊粉進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)隨著水解時(shí)間的變化，水解度的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)先快后慢的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，最終保持穩(wěn)定，達(dá)到最優(yōu)水解度的時(shí)間均不相同。

2）5種蛋白酶水解谷朊粉性能對(duì)比，復(fù)合蛋白酶水解谷朊粉水解度較大，水解后分子量較小，且后續(xù)蛋白回收率較大，因此選用復(fù)合蛋白酶作為后續(xù)谷朊粉改性用酶。

參考文獻(xiàn)：

［1］Xiangzhen Kong，Huiming Zhou，Haifeng Qian. Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysates［J］. Food Chemistry，2007（102）：759-763

［2］Adler-Nissen J. In enzymic hydrolysis of food proteins［M］. New York：Elsevier Applied Science Publisher，1986：263-313

［3］LGFonkwand RKSingh.Proteinrecoveryfrommechanically deboned turkey residue by enzymic hydrolysis［J］.Process Biochemistry，1996，31（6）：605-616

［4］杜長(zhǎng)安，陳復(fù)生.植物蛋白工藝學(xué)［M］.北京：中國(guó)商業(yè)出版社，1995：55-60

［5］何慧.堿處理面筋蛋白功能性之探討［J］.食品科學(xué)，1992，19（2）：241-252

［6］Bietz J A，Rothfus J A.Comparison of peptides from wheat gliadin and glutenin［J］. Cereal Chemistry，1970，47（4）：381-392

Studies on Screening Proteinase of Improving the Solubilitye of Wheat Gluten

QIU Bin1，F(xiàn)U Bo-fei1，2，XU Tong-cheng1，SUN Wen-jia1，DU Fang-ling1，*
（1. Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，Shandong，China；2. Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Abstract：Using the neutral protease，alkaline protease，flavor protease，pepsin and protemax protease to hydrolyze the wheat gluten separately，the following results showed：the the hydrolysis degree of wheat gluten hydrolyzed by protemax was bigger than hydrolyzed by others，the the molecular weight after hydrolyzed was smaller，and the subsequent protein recovery rate was bigger. Therefore the protemax was choosed as the subsequent modified enzyme for wheat gluten.

Key words：wheat gluten；solubility；proteinase；screen

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.004

基金項(xiàng)目：山東省引進(jìn)泰山學(xué)者海外特聘專家項(xiàng)目（魯財(cái)教［2012］45號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：邱斌（1982—），男（漢），助理研究員，博士，主要從事糧油加工。

*通信作者：杜方嶺（1972—），男（漢），碩士生導(dǎo)師，研究員。

收稿日期：2015-03-17