(周孝瓊,王華

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；福建省預(yù)防醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，福建龍巖364012)

陳慧芳，李炳貴，潘燦陽,邱靈珊

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖364012)

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馬齒莧水提醇沉液對大腸桿菌體內(nèi)外抗菌試驗

(周孝瓊,王華

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；福建省預(yù)防醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，福建龍巖364012)

陳慧芳，李炳貴，潘燦陽,邱靈珊

(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖364012)

[摘要]為了開發(fā)利用綠色中草藥馬齒莧(Portulaca oleracea L.)，進(jìn)行了馬齒莧水提醇沉液對大腸桿菌的體外抗菌試驗和人工感染肉兔大腸桿菌病的防治試驗，并測定血清中的總蛋白、白蛋白和球蛋白。結(jié)果表明，馬齒莧提取物濃度在0.50、1.00、2.00g/mL時，對大腸桿菌表現(xiàn)為中度敏感，且隨濃度的升高，抗菌效果增強(qiáng)；可顯著提高受大腸桿菌攻擊肉兔的存活率，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果；血清中蛋白含量預(yù)防組、治療組均比健康組和模型組高。可見馬齒莧水提醇沉液的體內(nèi)、體外抗菌效果表現(xiàn)基本一致，能抵抗大腸桿菌的感染，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力。

[關(guān)鍵詞]馬齒莧(Portulaca oleracea L.)；水提醇沉液；大腸桿菌；體內(nèi)外抗菌

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)為馬齒莧科馬齒屬的一年生肉質(zhì)草本植物，廣泛分布于溫帶和熱帶地區(qū)，在我國最為常見，是一種藥食同源的植物，具有清熱解毒、涼血止血的功效，民間廣泛用于治療腹瀉病[1,2]。肉兔大腸桿菌病又稱粘液性腸炎，是由致病性大腸桿菌及其產(chǎn)生的毒素所引起的一種暴發(fā)性腸道性疾病，當(dāng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)、氣候環(huán)境突變或患某些傳染病、寄生蟲病時引起抵抗力低下而發(fā)病。該病無明顯的季節(jié)性，以20日齡至4月齡仔兔易感，尤其是20日齡到斷奶前后發(fā)病率最高，以水樣或膠凍樣和嚴(yán)重脫水為主要特征。該病可經(jīng)消化道傳播引起大批死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究采用馬齒莧水提醇沉液對大腸桿菌進(jìn)行體外抗菌試驗和對肉兔進(jìn)行體內(nèi)防治試驗，同時對肉兔一些血液生化指標(biāo)進(jìn)行分析，以期為馬齒莧的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

中藥材馬齒莧采自福建省龍巖市東肖鎮(zhèn)田野，秋季全草采收，水洗，切碎于50℃烘箱中烘干備用。大腸桿菌菌種由龍巖學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所從接診的病兔中分離純化并鑒定為兔大腸桿菌。

試驗動物為2月齡加利福利亞兔,共32只，公母各半，體重(2.0±0.2)kg,由福建省龍巖市肉兔養(yǎng)殖場提供。

試驗LB培養(yǎng)基購自杭州濱和微生物試劑有限公司,總蛋白(產(chǎn)品編號：98-24018-US)、白蛋白(產(chǎn)品編號：98-24000-US)試劑盒購自北京安普生化科技有限公司。

試驗儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100為上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品，一體式超純水系統(tǒng)labtower15EDI為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，電子滅菌試驗裝置HVE-50為日本株式會社平山制作所產(chǎn)品，電子分析天平AL104-1C為梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品，血液生化分析儀IDEXX-VeTest為美國愛德士公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1家兔的飼養(yǎng)管理

采用漏糞底板的籠養(yǎng)方式，不含預(yù)混料的顆粒飼料喂養(yǎng)，自由采食、飲水。

1.2.2提取液的制備

采用水提取醇沉淀法，將馬齒莧10g分別用10、8、6倍量超純水浸泡蒸餾煮提3次，第一次回收蒸餾液，去渣，合并3次濾液，4層紗布過濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10mL。用75%乙醇醇提，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2，冰箱冷藏浸提48h后，濾紙過濾去除沉淀物質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，冷卻后再用85%乙醇醇提，重復(fù)以上操作，回收乙醇，最后加入1mL蒸餾成分，同時用0.5mL吐溫-80和無菌水調(diào)節(jié)至10mL，即得1g/mL的濃縮液，高壓蒸汽滅菌備用[3]。

1.2.3菌種的復(fù)壯與擴(kuò)增

將大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h，復(fù)壯后，用接種環(huán)取菌種一環(huán)置于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h，再用肉湯液稀釋，使菌液濃度每毫升含菌量為9×108，備用[4]。

1.2.4體外抗菌試驗

采用牛津杯法，取菌液100μL置于LB瓊脂平板表面，用涂布器反復(fù)涂布均勻后置于37℃恒溫箱中10min，表面干燥后取出，在每個平板上等距離平放打有標(biāo)記的牛津杯6只，每只杯內(nèi)分別加入等量的不同濃度的藥液240μL,于37℃培養(yǎng)24～48h[5],每種濃度設(shè)置6個重復(fù)，求平均值。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑≥20mm為極敏，用“”表示；15～19mm為高敏，用“”表示；10～l4mm為中敏，用“”表示；10mm 以下為低敏，用“+”表示；無抑菌圈為耐藥[6]。

1.2.5體內(nèi)抗菌試驗

在預(yù)飼養(yǎng)期間將家兔分為4組，預(yù)防組、治療組、模型組和健康組，每組各8只。健康組不致病不用藥；預(yù)防組、治療組、模型組每只家兔腹腔注射2mL的大腸桿菌菌液。模型組致病后不用藥；預(yù)防組致病前1周給藥，肌肉注射，1次/日，1mL/kg體重，用藥7d，致病后再用藥7d；治療組致病同時給藥，肌注，1次/日，2mL/kg體重，用藥7d。觀察10d，統(tǒng)計發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)和存活數(shù)。

1.2.6試驗兔血液中蛋白含量的測定

在接種大腸桿菌后的第3d，心臟采血2mL,離心取血清，用全自動血液分化分析儀檢測血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)的含量。

1.3數(shù)據(jù)分析與處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件的0ne-WayANOVA法進(jìn)行方差分析.差異顯著后進(jìn)行Duncan氏多重比較，以P<0.01(差異極顯著)，P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2結(jié)果與分析

表1　馬齒莧提取液對大腸桿菌的體外抑菌效果

注：“”表示中敏,“+”表示低敏。

2.1體外抑菌試驗

馬齒莧水提醇沉液的體外抑菌試驗結(jié)果見表1。

由表1可知，馬齒莧提取物濃度在2.00、1.00、0.50g/mL時，對大腸桿菌表現(xiàn)為中敏；濃度為0.25g/mL時，表現(xiàn)為低敏。

2.2體內(nèi)抑菌試驗

統(tǒng)計各組兔的發(fā)病情況，結(jié)果見表2。

表2　提取物防治試驗兔發(fā)病和死亡情況

由表2可知，試驗結(jié)束時，模型組家兔死亡率為62.5%，說明此次人工感染肉兔大腸桿菌病的模型是成功的。預(yù)防組和治療組的存活率分別為75.0%和62.5%，明顯高于模型組的37.5%。說明馬齒莧提取液對肉兔大腸桿菌病有一定的防治作用，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。

2.3各組試驗兔血液中的蛋白含量

利用SPSS軟件對各組試驗兔的血液蛋白檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。

表3　各組試驗兔血液中的蛋白含量　g/L

注：同列數(shù)據(jù)上標(biāo)小寫字母相同的表示兩者差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同的表示兩者差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，與健康組比較，預(yù)防組與治療組總蛋白顯著升高(P<0.05)；白蛋白預(yù)防組顯著高于健康組(P<0.05)；球蛋白治療組顯著高于健康組(P<0.05)。模型組TP、ALB、GLB與健康組差異不顯著，但都略有升高；預(yù)防組和治療組的TP、ALB、GLB與模型組差異不顯著，但均略有升高。

3討論

1)馬齒莧性寒，味甘酸；入心、肝、脾、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明馬齒莧具有抑菌、降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種功用[7]。本研究結(jié)果表明，馬齒莧提取液對大腸桿菌在體內(nèi)外均表現(xiàn)出一定的抑菌作用。在提取物濃度為0.50g/mL時，對大腸桿菌表現(xiàn)為中度敏感，而黃修奇[8]和侯俊然等[9]研究的結(jié)果是高度敏感，這可能與馬齒莧的產(chǎn)地、提取方法等有關(guān)，其原因有待進(jìn)一步探討。但馬齒莧水提醇沉液在動物抗感染試驗中，卻表現(xiàn)出了明顯的防治效果，而且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果，說明馬齒莧提取物可顯著提高受大腸桿菌攻擊肉兔的存活率，能改善動物機(jī)體的免疫機(jī)能和提高動物防御疾病能力。

2)血液生化指標(biāo)是反映物體內(nèi)物質(zhì)代謝和某些組織器官機(jī)能狀態(tài)變化的標(biāo)志，并被廣泛應(yīng)用于研究中[10]。血清固體成分中含量最多的一類物質(zhì)是血清總蛋白，它包括白蛋白和球蛋白2類，具有維持血管內(nèi)正常膠體滲透壓和酸堿度、運(yùn)輸多種代謝物、調(diào)節(jié)被運(yùn)輸物質(zhì)的生理作用等多種功能，并與機(jī)體的免疫功能有著密切關(guān)系[11，12]。本研究中，模型組攻毒后食欲下降，拉稀，導(dǎo)致血清中水分減少，使TP、ALB、GLB濃度相對增高。使用馬齒莧提取物防治，能使血清中蛋白含量升高，說明馬齒莧提取物中有效成分有利于機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，調(diào)控蛋白質(zhì)代謝，能抵抗大腸桿菌的感染，增強(qiáng)機(jī)體抗損傷的作用。

3)臨床上常用抗生素類藥物來防治肉兔大腸桿菌病，雖能取得較好的效果，但易造成耐藥性和胃

腸道菌群紊亂，危害機(jī)體健康。長期大量使用會造成藥物殘留，影響食品安全，危害人類健康。中草藥含有抗菌殺菌物質(zhì)、免疫活性物質(zhì)、改善酶活性物質(zhì)、有機(jī)酸及解毒和促進(jìn)毒素排泄的物質(zhì)等[13]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中，要堅持“養(yǎng)重于防、防重于治”的原則，在飼料中添加綠色無污染的中草藥添加劑，減少肉兔大腸桿菌病的發(fā)生。

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[收稿日期]2015-11-02

[基金項目]福建省教育廳A類項目(JA13309、JA15505)；龍巖學(xué)院服務(wù)海西建設(shè)項目(LQ2013027)。

[作者簡介]周孝瓊(1977-)，女，實驗師，主要從事畜禽疾病的中草藥防治研究。通信作者：王華，whomer@163.com。

[中圖分類號]Q949.745.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)09-0050-03

[引著格式]周孝瓊,王華,陳慧芳等.馬齒莧水提醇沉液對大腸桿菌體內(nèi)外抗菌試驗[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版) ，2016，13(9)：50～52,72.