張宇明　李寧　吳國(guó)才　聶麗容　何紅華　彭曉東.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東湛江　54000；.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，廣東湛江　54000

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Jak2v617f基因過(guò)表達(dá)及SAA患者血清對(duì)小鼠32D細(xì)胞體外培養(yǎng)中細(xì)胞因子濃度的影響

張宇明1李寧1吳國(guó)才1聶麗容1何紅華1彭曉東2
1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東湛江524000；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，廣東湛江524000

[摘要]目的觀察Jak2v617f轉(zhuǎn)染小鼠32D細(xì)胞后，與重癥再生障礙性貧血患者（severe aplastic anemia，SAA）血清共培養(yǎng)，了解Jak2v617f對(duì)SAA患者血清細(xì)胞因子水平的影響。方法利用DNA克隆技術(shù)，將mutJAK2（v617f）慢病毒轉(zhuǎn)染至32D細(xì)胞，檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別與正常血清與SAA患者血清培養(yǎng)后，血清細(xì)胞因子（IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α）水平的變化；同時(shí)觀察未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與SAA患者血清培養(yǎng)，加入Jak2抑制劑AZD148后，上述血清細(xì)胞因子水平的變化。結(jié)果SAA組（SAA血清+32D）與對(duì)照組（正常血清+32D）比較，血清細(xì)胞因子CD69差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），SAA組IL-2、IFN-γ則下降（P<0.05），TNF-α下降更明顯（P<0.01）；Jak2v617f組（Jak2v617f+正常血清+32D）則相反，除TNF-α外，余血清細(xì)胞因子水平均顯著高于對(duì)照組（P均< 0.01）；Jak2v617f+SAA組（Jak2v617f+SAA血清+32D）除CD69較對(duì)照組顯著升高外（P<0.01），余與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；AZD148組（正常血清+32D+Jak2抑制劑）與對(duì)照組比較，除CD69（P>0.05）外，余細(xì)胞因子均較對(duì)照組減少（P<0.05或P<0.01）；SAA+AZD148組（SAA血清+32D+Jak2抑制劑）與對(duì)照組比較，除CD69較對(duì)照組顯著升高（P<0.01）外，余均顯著減少（P均<0.01）。結(jié)論小鼠32D細(xì)胞Jak2v617f基因的過(guò)表達(dá)，有利于彌補(bǔ)SAA血清細(xì)胞因子的消耗；小鼠32D細(xì)胞加入Jak2抑制劑則有可能加重SAA血清細(xì)胞因子的消耗。

[關(guān)鍵詞]Jak2v617f；轉(zhuǎn)染；SAA；細(xì)胞因子；AZD148

Jak2v617f基因突變多見(jiàn)于BCR-ABL陰性的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliterative neoplasms，MPN），該病的臨床表現(xiàn)主要有白細(xì)胞增多、血紅蛋白增多及血小板增多等多血癥的表現(xiàn)，也可出現(xiàn)血栓及出血[1，2]；再生障礙性貧血的臨床表現(xiàn)則剛好相反，它主要表現(xiàn)為白細(xì)胞減少、血紅蛋白減少、血小板減少等骨髓衰竭的表現(xiàn)。Jak2v617f是骨髓增殖性腫瘤的致病因素[3，4]，而細(xì)胞因子則是再生障礙性貧血的致病因素[5]。本文探討將此兩種致病因素加以整合，能否將兩者的致病作用相抵消，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選擇2012年6月～2015年3月我院初治的SAA患者血清6例，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，男3例、女3例，年齡22～45歲。同期選擇我院健康體檢者血清6例，其中男3例、女3例，年齡25～45歲。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

mutJAK2（v617f）慢病毒由廣州萊德?tīng)柹锟萍加邢薰緟f(xié)助制備；小鼠32D細(xì)胞由廣州萊德?tīng)柹锟萍加邢薰咎峁?；?shí)驗(yàn)試劑：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B）；Mouse IL-2 Platinum ELISA（e bioscience，Cat.No.BMS601）；MouseCD69Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS614/2）；Mouse IFN-γ Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS606）；Mouse TNF-α Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS607/3）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

蘇州安泰潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-IFD），低速離心機(jī)（中佳，SC3614），倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2），細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific，HERA CELL150i），倒置熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B），流式細(xì)胞儀（BD，calibur）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

感染實(shí)驗(yàn)：將2×104L個(gè)32D細(xì)胞接種于96孔板，體積為100 μL，以第2天密度約50%左右為宜，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；次日，從冰箱取出mutJak2（v617f）慢病毒，并在37℃水浴中快速融化（輕輕晃動(dòng)約幾秒，以溶化液體中有少量冰塊為宜，立即取出），并立即用事先加熱到37℃的新鮮完全培養(yǎng)基（使用前加入Polybrene，終濃度6 mg/mL）加入2×106TU病毒（病毒濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），輕輕混勻；吸去32D細(xì)胞原有培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒液加入細(xì)胞中；輕搖勻，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；感染后第2天，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液（不含Polybrene），繼續(xù)37℃培養(yǎng)；感染后第3天，觀察GFP表達(dá)。另外，分別將2×105L個(gè)32D細(xì)胞接種于24孔板，按上述步驟加入慢病毒，準(zhǔn)備以下實(shí)驗(yàn)。

1.5實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分6組：對(duì)照組即小鼠32D細(xì)胞在含正常血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；SAA組即小鼠32D細(xì)胞在含SAA患者血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；Jak2v617f組即過(guò)表達(dá)Jak2v617f的小鼠32D細(xì)胞在含正常血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；Jak2v617f+SAA組即過(guò)表達(dá)Jak2v617f的小鼠32D細(xì)胞在含SAA患者血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；AZD148組即小鼠32D細(xì)胞在含正常血清及Jak2抑制劑培養(yǎng)基培養(yǎng)；SAA+AZD148組即小鼠32D細(xì)胞在含SAA患者血清及Jak2抑制劑培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.6推算直線方程

制定IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α等標(biāo)準(zhǔn)品的濃度曲線并推算直線方程。

1.6.1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?xiě)?yīng)用雙蒸水稀釋液重溶IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品，重溶后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為500 pg/mL，重溶后靜置10～30 min，稀釋前充分混勻。

1.6.2分別制定IL-2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算直線方程吸取225 μL樣本稀釋液到7個(gè)管，吸移225 μL重溶標(biāo)準(zhǔn)品（500 pg/mL）到第1管，標(biāo)記為S1（250 pg/mL），吸取225 μL此稀釋到第2管中，標(biāo)記為S2（125 pg/mL），重復(fù)連續(xù)稀釋液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)（圖1）。樣本稀釋液作為空白。

圖1　樣本連續(xù)稀釋圖

1.6.3推算直線方程同法制定CD69、IFN-γ及TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線及推算直線方程。

1.7血清IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α檢測(cè)

應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組樣本血清IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α的濃度。

1.7.1具體步驟加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品到標(biāo)準(zhǔn)品孔、100 μL樣本稀釋液到空白孔、50 μL樣本稀釋液到樣品孔、50 μL樣本到樣本孔，每組重復(fù)3管；所有孔加入50 μL生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，使用封板膜封板，400轉(zhuǎn)/min振蕩，室溫孵育2 h，棄掉液體，400 μL洗液洗板3次，加入400 μL洗液靜置浸泡10～15 s；加入100 μL/孔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素到所有孔，使用封板膜封板；400轉(zhuǎn)/min振蕩，室溫孵育1 h，棄掉液體，400 μL洗液洗板3次；加入400 μL洗液靜置浸泡10～15 s；加入100 μL/孔TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)10 min，每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。

1.7.2酶標(biāo)儀測(cè)定設(shè)定酶標(biāo)儀450 nm，波長(zhǎng)測(cè)定OD值，參考波長(zhǎng)設(shè)定為620 nm。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1鼠IL-2 ELISA檢測(cè)

根據(jù)IL-2的OD值與濃度的關(guān)系，繪制直線見(jiàn)圖2，并得到直線方程：y=0.0117x+0.1914，其中y代表OD值，x代表濃度（con），將各實(shí)驗(yàn)組OD值換算成濃度見(jiàn)表1，結(jié)果顯示：SAA組、AZD148組（Jak2抑制劑）及SAA+AZD148組與對(duì)照組比較，血清IL-2水平均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（前者P<0.05），后兩組降低趨勢(shì)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Jak2v617f組及SAA+Jak2v617f組則相反，IL-2水平較對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖2、3。

表1　鼠IL-2 ELISA檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

圖2　鼠IL-2 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　各組樣品檢測(cè)IL-2含量比較

2.2鼠CD69 ELISA檢測(cè)

利用2.1的檢測(cè)方法，同理得出以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、圖4、5：與對(duì)照組比較，血清CD69水平除Jak2v617f組升高外（P<0.01），SAA組、SAA+Jak2v617f組、AZD148組（Jak2抑制劑）、SAA+AZD148組與對(duì)照組比較，CD69水平均下降（前兩組P<0.05，后兩組P< 0.01），見(jiàn)圖4、5。

圖4　鼠CD69 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5　樣品檢測(cè)鼠CD69含量比較

表2　鼠CD69 ELISA檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

2.3鼠IFN-γ ELISA檢測(cè)

利用2.1的檢測(cè)方法，同理得出以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、圖6、7：與對(duì)照組比較，血清IFN-γ水平除Jak2v617f組升高外（但P>0.05），SAA組、SAA+AZD148組、SAA+Jak2v617f組及AZD148組（Jak2抑制劑），與對(duì)照組比較，IFN-γ水平均下降（前兩組P<0.01，后兩組P<0.05）。

表3　鼠IFN-γ ELISA檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

圖6　鼠IFN-γ ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7　樣品檢測(cè)鼠IFN-γ含量

2.4鼠TNF-α ELISA檢測(cè)

利用2.1的檢測(cè)方法，同理得出以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4、圖8、9：與對(duì)照組比較，血清TNF-α水平除SAA+ AZD148組（P<0.05）及AZD148組（P<0.01）與對(duì)照組比較升高外，SAA組、Jak2v617f組及SAA+Jak2v617f 組TNF-α水平均下降（P均<0.05）。

3　討論

重癥再生障礙性貧血是血液系統(tǒng)的危重疾病，骨髓呈嚴(yán)重的衰竭狀態(tài)，其藥物起效慢甚或無(wú)效，雖然治療方面造血干細(xì)胞移植技術(shù)取得了很大進(jìn)步[6，7]，但由于患者經(jīng)濟(jì)能力、年齡、病情嚴(yán)重程度等種種原因，仍有相當(dāng)一部分患者難以挽回生命；而血液系統(tǒng)的另一種疾病骨髓增殖性腫瘤，疾病狀況與再障則剛好相反，骨髓各系細(xì)胞顯著增生，本課題研究旨在探討上述兩病的致病因素共存時(shí)，其致病作用能否得以緩和。

表4　鼠TNF-α ELISA檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

圖8　Mouse TNF-α ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖9　樣品檢測(cè)鼠TNF-α含量

本課題組之前的研究證實(shí)，重癥再障患者的血清可抑制小鼠32D細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相反，轉(zhuǎn)染了Jak2v617f的小鼠32D細(xì)胞的增殖力則增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡則減少，這些結(jié)論均與文獻(xiàn)報(bào)道相仿[8-10]；另外將轉(zhuǎn)染了Jak2v617f的小鼠32D細(xì)胞置于含重再患者血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即將兩種致病因素加以整合，兩者的致病作用相互抵消，細(xì)胞的增殖力及凋亡數(shù)趨向正常，這些數(shù)據(jù)將在另文報(bào)道[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：小鼠32D細(xì)胞用重癥再障患者血清進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)血清白介素-2（IL-2）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及CD69含量均較正常對(duì)照組減少，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也類(lèi)似。既往研究顯示[12]，T細(xì)胞的免疫激活是再生障礙性貧血的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，T細(xì)胞激活后，由于其功能處于亢進(jìn)狀態(tài)，能分泌大量的細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，這些負(fù)調(diào)節(jié)因子作為一種致病因素將導(dǎo)致造血干細(xì)胞的損傷及增殖能力減退，并誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而引起骨髓衰竭即再障的發(fā)生；許多研究者也通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)[13，14]證實(shí)再障患者體內(nèi)IL-2、IFN-γ、TNF-α因子水平及CD69含量是升高的；本實(shí)驗(yàn)研究中IL-2、IFN-γ、TNF-α因子水平及CD69含量的減少可能由于重再患者血漿中的這些細(xì)胞因子作為致病因素，也能在體外作用于小鼠32D細(xì)胞，導(dǎo)致其類(lèi)似再障的改變：比如增殖力減弱、凋亡增多等，并在此過(guò)程中上述細(xì)胞因子被消耗，而體外缺乏活化的T細(xì)胞，這些細(xì)胞因子難以持續(xù)分泌，故而減少。

本實(shí)驗(yàn)研究還顯示：小鼠32D細(xì)胞轉(zhuǎn)染了Jak 2v617f基因后用正常血清培養(yǎng)，血清中IL-2、IFN-γ水平及CD69含量較對(duì)照組高，TNF-α則減少，小鼠32D細(xì)胞在正常血清培養(yǎng)時(shí)，如加入Jak2抑制劑AZD148，則這四種細(xì)胞因子濃度剛好相反，除TNF-α升高外，其他三種均降低。Jak2v617f作為骨髓增殖性腫瘤的致病基因，其致病機(jī)制主要由于位于JH2區(qū)617位的纈氨酸被分子量更大苯丙氨酸取代，導(dǎo)致原折疊區(qū)域被打開(kāi)，JH1活化環(huán)相互接近，Jak2持續(xù)活化，細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的敏感性增高，甚至在細(xì)胞因子不存在時(shí)，也能通過(guò)Jak2的活化及生長(zhǎng)因子受體的作用，使細(xì)胞更多向紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板轉(zhuǎn)化[15，16]；相反，加入Jak2抑制劑則有利于減少紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的數(shù)目[17,18]。本文推測(cè)，與此同時(shí)，也存在對(duì)負(fù)調(diào)節(jié)因子敏感性降低的情況，IL-2、IFN-γ水平及CD69等因子被利用減少，另外Jak2活化，也可導(dǎo)致STATS及其下游激酶的改變，使細(xì)胞凋亡減少，遂導(dǎo)致IL-2、IFN-γ水平及CD69水平升高；也有可能某一途徑激活后，這些因子分泌增多；TNF-α水平可能更為依賴(lài)于T細(xì)胞的活化，本實(shí)驗(yàn)活化T細(xì)胞較少，故TNF-α水平減低。如轉(zhuǎn)染Jak2v617f基因的小鼠32D細(xì)胞加入重癥再障患者血清培養(yǎng)，則在體外培養(yǎng)過(guò)程中，血清中上述細(xì)胞因子濃度趨向正常,說(shuō)明這兩種治病因素共存時(shí)，其致病作用得到抵消；如小鼠32D細(xì)胞在Jak2抑制劑AZD148及重癥再障患者血清共存的環(huán)境下培養(yǎng)，上述細(xì)胞因子進(jìn)一步下降，說(shuō)明Jak2抑制劑AZD148有可能加重重癥再障血清的致病作用。目前國(guó)內(nèi)外類(lèi)似研究甚少，其機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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Influence of Jak2v617f overexpression and SAA patients'serum on cytokines concentrations in mice 32D cells in vitro culture

ZHANG Yuming1LI Ning1WU Guocai1NIE Lirong1HE Honghua1PENG Xiaodong2
1.Internal Hematology Department,the Affliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang524000,China;
2.Emergency Department,the Affliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang524000,China

[Abstract]Objective To observe Jak2v617f-transfected mice 32D cells which were co-cultured with severe aplastic anemia(SAA)patients'serum and to understand the impact of Jak2v617f on cytokines levels in SAA patients'serum. Methods DNA cloning technology was used to transfect the mutJak2(v617f)lentivirus into 32D cells,and changes of serum cytokines(IL-2,CD69,IFN-γ,changes in TNF-α)levels were detected after the untransfected group cells and the transfected cells were co-cultured with normal serum and SAA patients'serum respectively.And in the same time, changes of the serum cytokines levels were detected after the untransfected group cells were co-cultured with SAA patients'serum and Jak2 inhibitor ADZ148 was added to them.Results There was no significant difference in comparing serum cytokine CD69 of the SAA group(SAA serum+32D)and the control group(normal serum+32D)(P>0.05).Compared with the control group,IL-2,IFN-γ in SAA group decreased(P<0.05),and TNF-α in SAA group decreased more significantly(P<0.01).On the contrary,the remaining serum cytokines levels of the Jak2v617f group(Jak2v617f+normal serum+32D)were significantly higher than those of the control group,in addition to TNF-α(P<0.01).The increase of CD69 in the Jak2v617f+SAA group(Jak2v617f+SAA serum+32D)was significantly higher than that in the control group (P<0.01),and there were no significant differences in comparing other serum cytokines levels of the Jak2v617f+SAA group and the control group(P>0.05).Compared with the control group,the other cytokines of AZD148(normal serum+ 32D+Jak2 inhibitor)excepted for CD69(P>0.05)increased(P<0.05，or P<0.01).Compared with the control group,CD69 of the SAA+AZD148 group(SAA serum+32D+Jak2 inhibitor)significantly increased(P<0.01),but the other cytokines significantly reduced(P<0.01).Conclusion Overexpression of mice 32D cells gene Jak2v617f can help make up for the consumption of SAA serum cytokines and mice 32D cells with Jak2 inhibitor are likely to increase the consumption of SAA serum cytokines.

[Key words]Jak2v617f;Transfection;SAA;Cytokine;AZD148

[中圖分類(lèi)號(hào)]R556.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-9701（2016）04-00019-06

[基金項(xiàng)目]廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031800344）

收稿日期：（2015-11-27）