李紅蓉，位庚，孫穎，李輝欣，梁俊清，賈振華

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通絡(luò)藥物對血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞黏附作用的影響

李紅蓉，位庚，孫穎，李輝欣，梁俊清，賈振華

摘要

目的：觀察氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）與人白血病單核細(xì)胞（THP-1）的黏附作用，以及通絡(luò)藥物（通心絡(luò)超微粉溶液和人參皂苷Rb1）干預(yù)的影響。

方法：采用ox-LDL建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，將細(xì)胞分為正常對照組、模型組、通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組。實(shí)驗(yàn)采用MTS比色法檢測ox-LDL損傷的HUVEC的生存活性，用活細(xì)胞染色方法觀察不同組HUVEC與THP-1細(xì)胞的黏附率，用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法檢測HUVEC培養(yǎng)上清中單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1）、可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子（sVCAM-1）、可溶性內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子（sICAM-1）、E-選擇素（E-selectin）的水平，用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測各組HUVEC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的單核細(xì)胞趨化因子受體2（CCR2）、極遲抗原4（VLA-4）、巨噬細(xì)胞分化抗原-1（Mac-1）的表達(dá)。

結(jié)果：與正常對照組（100.00±1.31）%比較，模型組HUVEC生存活性降低為正常對照組的（75.57±1.02）%，通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組HUVEC生存活性明顯分別提高了（99.25±1.40） %、（99.48±2.15） %。與正常對照組比較，模型組黏附于HUVEC的THP-1細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與模型組比較，通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組黏附于HUVEC細(xì)胞的THP-1細(xì)胞數(shù)量減少。通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1、sVCAM-1、sICAM-1、E-selectin的水平和THP-1細(xì)胞上相應(yīng)受體CCR2、VLA-4、Mac-1的表達(dá)較模型組降低。上述比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：通心絡(luò)和人參皂苷Rb1能夠保護(hù)HUVEC，減少ox-LDL損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、黏附分子的分泌及單核細(xì)胞上相應(yīng)受體的表達(dá)，從而抑制單核細(xì)胞向受損血管內(nèi)皮的趨化黏附。

關(guān)鍵詞通心絡(luò)；人參皂苷Rb1；氧化低密度脂蛋白；內(nèi)皮，血管；單核細(xì)胞

作者單位：050017河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)（李紅蓉、位庚）；泰安市中醫(yī)醫(yī)院（孫穎）；河北以嶺醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室（李輝欣、梁俊清、賈振華）

（Chinese Circulation Journal，2016，31：480.）

氧化低密度脂蛋白 （ox-LDL）等危險(xiǎn)因素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），通過信號傳導(dǎo)通路改變內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性，介導(dǎo)單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附進(jìn)而形成脂質(zhì)條紋、脂質(zhì)斑塊是動脈粥樣硬化（AS）的初始環(huán)節(jié)。通心絡(luò)是絡(luò)病理論指導(dǎo)研制的通絡(luò)代表方藥，具有血管、血液、心臟三重保護(hù)作用，人參作為君藥有益氣通絡(luò)、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。本研究觀察ox-LDL損傷的HUVEC與人白血病單核細(xì)胞（THP-1）的黏附作用及通絡(luò)藥物（通心絡(luò)超微粉溶液和人參皂苷Rb1）干預(yù)的影響。

1 材料與方法

材料：HUVEC、THP-1 （購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），通心絡(luò)超微粉（石家莊以嶺藥業(yè)），人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡稱Rb1，購自北京中科儀友化工技術(shù)研究院），DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco），胰蛋白酶（美國Amersco），ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑，內(nèi)鹽（MTS）細(xì)胞生存活性檢測試劑（美國Promega），Hoechst 33342細(xì)胞核染料（美國AAT Bioquest），單核細(xì)胞趨化因子（MCP-1） 酶聯(lián)免疫吸附測定（ ELISA）試劑盒（美國abcam），可溶性細(xì)胞間黏附分子（sICAM-1）、可溶性血管細(xì)胞間黏附分子（sVCAM-1）、E-選擇素（E-selectin） ELISA試劑盒（美國R﹠D Systems），兔抗人單核細(xì)胞趨化因子受體2（CCR2）、極遲抗原4 （VLA-4）、巨噬細(xì)胞分化抗原-1（Mac-1）抗體（美國abcam），BCA 蛋白定量分析試劑盒、細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒（美國Pierce ）。多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek），轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad），odyssey掃膜儀（美國Li-Cor）、顯微鏡（德國ZEISS）。

通心絡(luò)超微粉溶液的制備：取適量通心絡(luò)超微粉溶于無血清DMEM培養(yǎng)基，超聲促溶1 h，6 500 g離心10 min，收集上清液并用0.22 μm微孔濾器過濾除菌，離心所得沉淀于60 ℃加熱烘干并稱量，以校正和計(jì)算所得上清中藥物濃度，于-20℃保存?zhèn)溆?，用時(shí)稀釋至目標(biāo)濃度。

分組及給藥：實(shí)驗(yàn)分為4組，正常對照組以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，模型組以含有ox-LDL （30 μg/ml）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，通心絡(luò)組（150 μg/ml ） 和人參皂苷Rb1組 （120 μg/ml） 的無血清培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4 h，再加入ox-LDL（30 μg/ml）、通心絡(luò)（150 μg/ml ） 及人參皂苷Rb1（120 μg/ml ） 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

各組HUVEC生存活性：將對數(shù)生長期的HUVEC以1×105/ml 接種于96孔板，10% FBS、37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%融合，棄去原培養(yǎng)基。按上述方法處理細(xì)胞，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，參照文獻(xiàn)［1］用MTS比色法檢測各組HUVEC生存活性。

HUVEC與THP-1黏附率測定：按前述方法將HUVEC接種于玻底96孔板常規(guī)培養(yǎng)，并對各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，黏附率檢測方法參照文獻(xiàn)［2］并進(jìn)行改進(jìn)，將正常培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞用Hoechst 33342 染料進(jìn)行活細(xì)胞核染色15 min，PBS洗去多余染料，用無血清培養(yǎng)基重懸，以5×105/ml 密度加入到處理好的HUVEC中，共培養(yǎng)6 h，PBS洗去未黏附的THP-1細(xì)胞，用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察發(fā)生黏附的THP-1，用Image J圖像處理系統(tǒng)計(jì)算各視野THP-1細(xì)胞數(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1、sVCAM-1、sICAM-1、E-selectin水平檢測：按上述方法處理HUVEC，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，依參照文獻(xiàn)［3］按ELISA試劑盒說明書所示檢測HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1、sVCAM-1、sICAM-1、E-selectin的水平。

蛋白免疫印跡方法檢測各組THP-1細(xì)胞CCR2、Mac-1、VLA-4蛋白的表達(dá)：按上述方法將HUVEC接種于6孔板，并對各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，棄去各組細(xì)胞培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞24 h，收集各組THP-1細(xì)胞，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，用蛋白免疫印跡方法測定各組蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，方差齊同，采用LSD方法；方差不齊，用Dunnett T3方法進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組HUVEC生存活性變化的比較：與正常對照組比較（100.00±1.31）%，模型組HUVEC生存活性降低為正常對照組的（75.57±1.02）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組HUVEC生存活性分別提高（99.25±1.40） %、（99.48±2.15） %，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；通心絡(luò)組與人參皂苷Rb1組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

各組HUVEC與THP-1細(xì)胞黏附數(shù)量的比較：與正常對照組THP-1黏附數(shù)量［（113±31）個(gè)］比較，模型組黏附于HUVEC的THP-1數(shù)量［（877±152）個(gè)］明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組黏附于HUVEC的THP-1數(shù)量減少［（304±27）個(gè)、（294±41）個(gè)］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

各組HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin水平的比較（表1）：與正常組比較，模型組HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，通心絡(luò)組和人參皂苷Rb1組HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

各組THP-1細(xì)胞VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達(dá)的比較（圖1、表2）：與正常對照組比較，經(jīng)HUVEC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后的THP-1上趨化、黏附分子相應(yīng)受體VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與模型組比較，通心絡(luò)和人參皂苷Rb1 組VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1 及E-selectin表達(dá)水平的比較（ n=4，±s）

表1　各組HUVEC培養(yǎng)上清中MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1 及E-selectin表達(dá)水平的比較（ n=4，±s）

注：HUVEC：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； MCP-1：單核細(xì)胞趨化因子；sICAM-1：可溶性細(xì)胞間黏附分子1； sVCAM-1：可溶性血管細(xì)胞間黏附分子1； E-selectin：E-選擇素。與正常對照組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01

組別　MCP-1 （pg/ml）sICAM-1 （ng/ml）sVCAM-1 （ng/ml）E-selectin （ng/ml）正常對照組　57.45±2.33　0.22±0.01　2.65±0.37 0.84±0.04模型組　194.80±1.38*2.31±0.07*13.62±0.47*5.66±0.03*通心絡(luò)組　93.54±1.61△0.82±0.02△6.03±0.33△2.90±0.03△人參皂苷Rb1組108.16±1.65△0.84±0.03△6.31±0.51△3.09±0.04△

圖1　蛋白免疫印跡法檢測THP-1細(xì)胞VLA-4、Mac-1、CCR2蛋白表達(dá)

表2　THP-1細(xì)胞VLA4、Mac-1、CCR2的蛋白表達(dá)的比較（n=3，±s）

表2　THP-1細(xì)胞VLA4、Mac-1、CCR2的蛋白表達(dá)的比較（n=3，±s）

注：THP-1：白血病單核細(xì)胞。VLA4：極遲抗原4 ；Mac-1；巨噬細(xì)胞分化抗原-1；CCR2 ：單核細(xì)胞趨化因子受體2。與正常對照組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01

組別　VLA-4　Mac-1　CCR2正常對照組　0.10±0.01　0.09±0.01　0.10±0.02模型組　0.72±0.03*　0.81±0.07*　0.82±0.06*通心絡(luò)組　0.10±0.01△　0.11±0.04△　0.13±0.03△人參皂苷Rb1組　0.11±0.01△　0.12±0.04△　0.12±0.01△

3 討論

動脈粥樣硬化以脂質(zhì)堆積和炎癥細(xì)胞在動脈壁聚集形成脂質(zhì)條紋和粥樣斑塊為特征。體積較小的低密度脂蛋白（LDL）是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的最主要脂蛋白顆粒，LDL滲入動脈壁便開始了促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成過程［4］。ox-LDL導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)大量的趨化、黏附分子，促進(jìn)循環(huán)血中單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮滾動黏附，在趨化信號的作用下遷移進(jìn)入血管內(nèi)皮下層吞噬脂質(zhì)形成脂質(zhì)條紋的主要成分——泡沫細(xì)胞［5］。本實(shí)驗(yàn)中ox-LDL在30 μg/ml時(shí)導(dǎo)致HUVEC生存率下降至正常的75%左右，損傷后的HUVEC胞趨化、黏附分子MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin表達(dá)增高，與既往研究一致［6］。

趨化、黏附分子在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，E-selectin表達(dá)于炎癥部位的內(nèi)皮細(xì)胞，可以介導(dǎo)單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面最初的滯留和滾動。MCP-1是趨化單核細(xì)胞向血管壁滾動的最主要趨化因子，能劑量依賴性的誘導(dǎo)其特異受體CCR2的表達(dá)。二者相互作用介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，對動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)過程中單核細(xì)胞的遷移和游走及單核細(xì)胞的募集極為重要［7］。敲除CCR2或MCP-1基因可阻斷血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞浸潤和聚集并減輕動脈粥樣硬化病變［7，8］。ICAM-1/ Mac-1、VCAM-1/VLA-4相互作用介導(dǎo)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮的緊密黏附，并促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移［9］。表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1、VCAM-1與內(nèi)膜的泡沫細(xì)胞數(shù)、動脈粥樣硬化病變程度呈顯著正相關(guān)，血中可溶性ICAM-1、VCAM-1是反應(yīng)動脈粥樣硬化早期變化的指標(biāo)。用單克隆抗體阻斷的方法或應(yīng)用P-選擇素，E-selectin，ICAM-1，VCAM-1，VLA-4基因剔除小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏黏附分子的小鼠給予高脂飲食后誘發(fā)的粥樣硬化斑塊與模型組小鼠相比明顯縮?。?0］。

本實(shí)驗(yàn)采用ox-LDL造成HUVEC損傷，ox-LDL可明顯增強(qiáng)HUVEC與THP-1細(xì)胞的黏附，促進(jìn)MCP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin的分泌，經(jīng)ox-LDL損傷的HUVEC條件培養(yǎng)基對THP-1 CCR2、Mac-1、VLA4蛋白的表達(dá)也有上調(diào)作用；而通心絡(luò)和人參皂苷Rb1干預(yù)可以抑制ox-LDL損傷的HUVEC 與THP-1細(xì)胞的黏附，減少M(fèi)CP-1、sICAM-1、sVCAM-1、E-selectin的分泌，同時(shí)減少HUVEC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞CCR2、Mac-1、VLA4蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果提示，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后可以影響THP-1細(xì)胞，而通心絡(luò)和人參皂苷Rb1作用后可以通過保護(hù)HUVEC，減少THP-1細(xì)胞的黏附，從而減少巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞，抑制脂質(zhì)條紋和脂質(zhì)斑塊的形成，起到抗動脈粥樣硬化作用。

單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是內(nèi)皮細(xì)胞功能受損而處于激活狀態(tài)的表現(xiàn)之一，兩種細(xì)胞黏附不僅是物理接觸，而且涉及單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面諸多分子之間的相互作用，在相互作用過程中兩種細(xì)胞的功能均發(fā)生相應(yīng)變化，促進(jìn)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，而細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及損傷作用則被認(rèn)為是動脈粥樣硬化重要的始動環(huán)節(jié)，可作為炎癥活動的指標(biāo)。此過程涉及多條信號通路的參與，其中血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）的作用對于ox-LDL損傷HUVEC尤為重要，ox-LDL可濃度依賴性上調(diào)LOX-1的表達(dá)，通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的LOX-1集合激活內(nèi)皮，從而影響內(nèi)皮功能，損傷血管導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［11］。對于通心絡(luò)和人參皂苷Rb1是否是通過上述某條或某幾條通路發(fā)揮作用，將進(jìn)行進(jìn)一步研究。

通心絡(luò)膠囊是脈絡(luò)學(xué)說指導(dǎo)研制的通絡(luò)代表方藥，具有血管保護(hù)、血液保護(hù)、心臟保護(hù)三重作用，在臨床心腦血管疾病防治中發(fā)揮重大作用。人參是其君藥，有益氣通絡(luò)的作用。既往研究表明，通心絡(luò)膠囊和人參有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、防治動脈粥樣硬化的作用［12］。本研究通過ox-LDL造成HUVEC損傷模型，與單核細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了通心絡(luò)及其組方成分人參皂苷Rb1具有保護(hù)血管，抑制脈絡(luò)瘀阻，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

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（編輯：曹洪紅）

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

Effect of Dredging Collateral Drug on ox-LDL Injured THP-1 Cells Adhesion to Human Umbilical Vein Endothelial Cells in vitro

LI Hong-rong，WEI Geng，SUN Ying，LI Hui-xin，LIANG Jun-qing，JIA Zhen-hua.
Hebei Medical University，Shijiazhuang （050017），Hebei，China

Abstract

Objective：To observe the effect of oxidative-low density lipoprotein （ox-LDL） injured human leukemia mononuclear cells （THP-1） adhesion to human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in vitro with the intervening function of dredging collateral drug，tongxinluo （TXL） and ginsenoside （Rb1）.

Methods：Cell injury was induced by ox-LDL treatment.The cells were divided into 4 groups：①Normal control group，②Injury model group，the cells were cultured by ox-LDL，③TXL group，the cells were cultured with both ox-LDL and TXL，④Rb1 group.HUVEC viability was measured by MTS assay，adherence rate of THP-1 cells to HUVECs was tested by vital cell staining.The contents of monocyte chemoat-tractant protein （MCP-1），soluble vascular cell adhesion molecule （sVCAM-1），soluble inter vascular cell adhesion molecule-1 （sICAM-1） and E-selectin in HUVEC conditioned medium were detected by ELISA； protein expressions of CCR2，VLA4 and Mac-1 in THP-1 cells were examined by Western blot analysis.

Results：Compared with Control group，HUVEC viability was decreased in Injury model group （100 ±1.31） % vs（75.57 ± 1.02） %，while increased in both TXL and Rb1 groups （99.25 ± 1.40） % and （99.48 ± 2.15） %； Injury model group showed elevated adherence rate of THP-1 cells to HUVECs，while the adherence rates were reduced in both TXL and Rb1 groups.Compared with Injury model group，TXL group and Rb1 group showed decreased levels of MCP-1，sVCAM-1，sICAM-1 and E-selectin in HUVEC conditioned medium； decreased protein expressions of CCR2，VLA4 and Mac-1 in THP-1 cells.

Conclusion：TXL and Rb1 could protect HUVECs，reduce ox-LDL injury induced vascular endothelial cell adhesion and decrease relevant receptor expression in monocytes； therefore，inhibit injured monocytes adherence to vascular endothelial cells.

Key wordsTongxinluo； Ginsenoside Rb1； Oxidative-low density lipoprotein； Endothelium，vascular； Monocytes

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 973計(jì)劃（2012CB518606）

作者簡介：李紅蓉碩士主要從事中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究Email：hongrongli@126.com通訊作者：李紅蓉

中圖分類號：R541

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0480-04

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.015

Corresponding Author：LI Hong-rong，Email：hongrongli@126.com

收稿日期：（2015-08-05）