李詩瑩，鄒曉，許啟有，劉瑤，付世新（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

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治療奶牛乳房炎中藥混懸型注射劑安全性試驗(yàn)

李詩瑩，鄒曉，許啟有，劉瑤，付世新
（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

摘要：為了檢驗(yàn)自制中藥混懸型乳房注射劑的安全性，試驗(yàn)通過對注射劑熱原性、溶血性、肌肉刺激性、皮膚過敏性、急性毒性以及對健康奶牛乳房刺激性進(jìn)行了全面的考察研究，結(jié)果表明該注射劑符合使用動(dòng)物新獸藥的安全性，為臨床安全使用該注射劑提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：奶牛；乳房炎；中藥混懸型注射劑；安全性；試驗(yàn)

目前奶牛乳房炎已成為破壞牛奶質(zhì)量最主要的疾病之一，給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來重大損失。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，在我國奶牛乳房炎感染率高達(dá)70%～80%，其中奶牛隱性乳房炎感染率占46.3%，每年給畜牧業(yè)造成1.35億人民幣的損失[1]。隨著廣大消費(fèi)者對“無抗”和優(yōu)質(zhì)奶源需求的不斷提高，如何獲得“安全奶”這一問題已引起畜牧業(yè)工作者的高度重視。

我國傳統(tǒng)中藥含有的有效生物成分具有抗菌、活血、清熱、消炎、解毒等功能，更主要是病原微生物不易產(chǎn)生耐藥性，并且在動(dòng)物體內(nèi)高效、低毒、無殘留。中藥也能增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的特異性或非特異性免疫力，從而達(dá)到有效控制奶牛乳房炎的效果[2]。但是中藥成分復(fù)雜，并非無任何毒副作用，目前已出現(xiàn)中藥制劑產(chǎn)生毒副作用的相關(guān)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)中的中藥注射劑是一種以甘草總黃酮為主要成分的純中藥混懸型乳房注射劑。根據(jù)該中藥藥效特點(diǎn)及乳房注射的給藥方式設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)，全面評價(jià)該中藥制劑臨床用藥的安全性。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

健康家兔（2.5 kg左右，雌雄各半），由大慶市某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；小白鼠（22 g左右，雌雄各半），由大慶市某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；奶牛（泌乳中期）來源于大慶市某牛場，經(jīng)CMT法檢測乳房炎為陰性的健康泌乳期奶牛。

1.1.2試劑

中藥混懸型乳房注射劑（吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制），批號20140501；注射用生理鹽水（長春豪邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），批號為20140123；2，4—二硝基氯苯（石家莊莫高化學(xué)試劑有限公司），批號為20140223；CMT診斷試劑（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1熱原檢查

通過家兔發(fā)熱實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行檢測，并按照《中華人民共和國獸藥典（2005年版）》上規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行[3]。

1.2.2溶血試驗(yàn)

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典（2005年版）》上規(guī)定步驟進(jìn)行中藥混懸液是否溶血的試驗(yàn)[3]。

（1）進(jìn)行2%兔紅細(xì)胞混懸液的配制

取1只健康家兔，從心臟取血（約20 mL），用玻璃棒勻速同方向攪動(dòng)（10 min）去除纖維蛋白，然后向血中加入10倍量生理鹽水（約180 mL）。繼續(xù)用玻璃棒混勻后進(jìn)行離心（1 000～1 500 r·min-1，15 min），然后將上清液棄除，同樣方式反復(fù)繼續(xù)用生理鹽水清洗4次，直到肉眼觀看上清液不顯紅色停止，最后用生理鹽水按所得的紅細(xì)胞的容積配制成2%的兔紅細(xì)胞混懸液，供試驗(yàn)用。

（2）溶血與凝集檢查

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備5支干凈透明玻璃試管并進(jìn)行編號（1～5），如表1所示1～2號，3號、4號、5號試管依次是供試品管、陰性對照管、陽性對照管、供試藥品對照管。按照順序加入對應(yīng)試劑和藥液后進(jìn)行混勻，立即放置在的恒溫箱（37℃）中，在2h后觀察并記錄溶血和凝集情況。

表1　溶血實(shí)驗(yàn)Table 1Test of hemolysis

1.2.3皮膚過敏性試驗(yàn)

對18只家兔隨機(jī)進(jìn)行分組，共分為3組（每組6只），分別為中藥混懸液組、2，4—二硝基氯苯對照組和生理鹽水對照組。給藥前脫毛處理18只家兔（脊柱兩側(cè)背部皮膚，左、右各5×6 cm2），處理時(shí)注意不要刮傷兔子皮膚。每組家兔分別用1 mL中藥混懸液、生理鹽水、1%DNCB（2，4—二硝基氯苯）涂于家兔脫毛區(qū)皮膚上，無刺激醫(yī)用紗布覆蓋，進(jìn)行致敏接觸。首次給藥后在第7 d，第21 d各組分別取出3只家兔，以同樣方式進(jìn)行攻擊。各組家兔在6 h給藥攻擊后用溫水擦去皮膚上的受試物，觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，記錄家兔是否出現(xiàn)抓鼻、豎毛、干咳、休克顫抖、呼吸困難等癥狀。在24 h再次進(jìn)行觀察并對皮膚紅斑和水腫進(jìn)行評分，評分原則按照表2、表3中的《皮膚過敏反應(yīng)程度的評分標(biāo)準(zhǔn)》、《皮膚致敏性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》。

表3　供試藥對皮膚致敏反應(yīng)強(qiáng)度分級Table 3Strength rating of skin anaphylactic

1.2.4肌肉刺激性試驗(yàn)

參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法》（陳奇，1994）對健康家兔腿部肌內(nèi)注射法進(jìn)行研究[4]。

實(shí)驗(yàn)前，對健康家兔（2只）的左右兩條后腿股四頭肌處進(jìn)行剃毛，并用記號筆標(biāo)記。對右側(cè)后肢、左側(cè)后肢脫毛處依次注射1 mL中藥混懸液和滅菌生理鹽水。分別與24、48 h后，觀察注藥部位的反應(yīng)變化情況，在48 h后處死家兔，取出并用手術(shù)刀縱向切開股四頭肌，觀察內(nèi)部肌肉組織注射部位的刺激反應(yīng)及藥液吸收情況，如果需要進(jìn)行可疑組織做病理切片。反應(yīng)結(jié)果按表4分級。

表4　中藥混懸型注射液對家兔腿部肌肉組織反應(yīng)分級Table 4Anaphylaxis scores of muscle tissue of chinese medicinal herbs suspension injection on rabbit

1.2.5急性毒性試驗(yàn)

1.2.5.1預(yù)試驗(yàn)

取24只雌雄各半、禁食16 h左右的小鼠，隨機(jī)分成四組。分別為中藥高0.4 mL（20 g小鼠最大給藥劑量）、中0.2 mL、低0.1 mL劑量組、生理鹽水對照組。每組給藥方式均為腹腔注射藥物一次。給藥后連續(xù)觀察至第七天，無一例死亡，具體結(jié)果見表5。由于供試小鼠均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，難以測得半數(shù)致死量（LD50），故采用最大給藥量（MLD）的測定方法進(jìn)行正式試驗(yàn)。

表5　急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)Table 5　Pre-test of acute toxicity test

1.2.5.2正式試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果說明中藥混懸液毒性很低，因此采用24 h內(nèi)3次給藥的方法測定藥物的最大給藥劑量。取禁食12 h的小鼠40只，分為中藥給藥組、生理鹽水對照組。稱重后經(jīng)腹腔注射中藥，每8個(gè)h給藥一次，每次0.4 mL，生理鹽水組給藥方式一樣，進(jìn)行毒性觀察。連續(xù)觀察一周，第7 d處死并剖檢全部小鼠，記錄小鼠內(nèi)臟（心、肝、肺、腎）的病理變化。

1.2.6健康奶牛乳房刺激性試驗(yàn)

1.2.6.1刺激性試驗(yàn)方案

選擇12頭四個(gè)乳區(qū)CMT檢測均為陰性，乳汁中未分離到細(xì)菌，奶牛在1個(gè)月內(nèi)沒有灌注抗生素的健康泌乳期奶牛，隨機(jī)分成四組，每組3頭。A組為30 mL中藥試驗(yàn)組，B組為60 mL中藥試驗(yàn)組，C組為100 mL中藥試驗(yàn)組，D組為100 mL生理鹽水對照組。試驗(yàn)組均在早上擠奶完畢后，分別以不同的劑量將中藥混懸型注射劑灌注到左前乳區(qū)，灌注一次，對照組以100 mL生理鹽水灌注到左前乳區(qū)。注射后24 h、48 h、72 h、96 h，1周觀察奶牛乳房的外觀，并采集藥物灌注乳區(qū)奶樣50 mL，12 h內(nèi)送檢。1.2.6.2檢測指標(biāo)

在給藥后24、48、72 h，1周觀察乳房的變化情況，記錄奶牛乳房是否紅、腫、熱、痛或激癢的反應(yīng)，同時(shí)測量其體溫，待乳汁中無藥殘留及藥液完全吸收后觀察奶牛的乳房及全身變化情況，判斷中藥混懸液對乳腺組織有無刺激性傷害。采集乳樣，觀察給藥前后乳汁變化，是否凝塊，并采集乳汁進(jìn)行體細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1熱原檢查

熱原檢查結(jié)果見表6。試驗(yàn)過程中家兔的體溫變化均不明顯，每只家兔的體溫升高均小于0.6℃，3只家兔體溫升高總和在1.4℃以下，表明該自制中藥混懸型注射劑的熱原測定符合獸藥典的規(guī)定。

表6　對中藥混懸型注射劑熱原檢查結(jié)果Table 6Results of chinese medicinal herbs suspension injection on rabbit body temperature

2.2溶血與凝集檢查

試驗(yàn)結(jié)果為：3號陰性對照管中均未見溶血和紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象發(fā)生；4號陽性對照管管底無紅細(xì)胞殘留，溶液紅色透明，證明發(fā)生全溶血；5號管中藥顏色未發(fā)生變化，仍為黃色，澄明度很高；1、2號供試藥品試驗(yàn)管中，可以觀察到紅細(xì)胞均下沉，上清液無色澄明，證明無溶血和凝集，以上結(jié)果證明該中藥混懸型注射劑無溶血和凝集性。

2.3皮膚過敏性試驗(yàn)結(jié)果

過敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，家兔在涂抹2，4—二硝基氯苯后致敏率為100%，屬于極強(qiáng)度致敏物。家兔在涂抹中藥混懸液后皮膚均未出現(xiàn)水腫、紅斑現(xiàn)象，并且沒有出現(xiàn)哮喘、站立不穩(wěn)、休克等全身性過敏癥狀，致敏率為0%，證明該藥屬于弱致敏物。

2.4肌肉刺激性試驗(yàn)結(jié)果

兩只兔子在48 h處死后，解剖取出的股四頭肌進(jìn)行縱向切開，經(jīng)觀察中藥注射部位的肌肉組織與生理鹽水注射的對照部位肌肉組織沒有明顯病理變化。中藥混懸型注射劑對肌肉的刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為兩只家兔的平均反應(yīng)級數(shù)在2以下，可供肌肉注射之用。

2.5急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

通過預(yù)試驗(yàn)，無法進(jìn)行LD50的計(jì)算。因此采用給予動(dòng)物理論能夠接受的最大濃度下的最大體積進(jìn)行毒性測定的方法，通過觀察7 d內(nèi)是否產(chǎn)生不良反應(yīng)。經(jīng)過異常毒性正式試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)死亡小白鼠為0只，對生理鹽水組和中藥混懸液低劑量組的小白鼠進(jìn)行對比觀察，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠反應(yīng)無差別，精神狀態(tài)和食欲都未出現(xiàn)異常；雖然中藥組中劑量、高劑量組的小鼠給藥后精神稍微不振，被毛有些凌亂且缺少光澤，食欲也不是最好狀態(tài)，但是第二天狀態(tài)好轉(zhuǎn)，所有小鼠均恢復(fù)正常。以上結(jié)果說明該中藥混懸型注射劑毒性極小，符合臨床使用安全性。

2.6奶牛乳房刺激性試驗(yàn)結(jié)果

由表7可以看出，A組～D組的奶牛左前乳區(qū)乳房外觀與乳汁外觀都沒有什么變化；乳汁體細(xì)胞數(shù)是評價(jià)生鮮乳質(zhì)量和奶牛健康狀況的重要指標(biāo)[5]，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明（表8）100 mL最高劑量的中藥組和100 mL劑量的生理鹽水對照組乳汁體細(xì)胞數(shù)相同天數(shù)間無顯著差異（P＞0.05），證明該中藥混懸液對奶牛乳房炎的刺激性與生理鹽水刺激程度相同，間接證明此中藥混懸型注射劑對奶牛乳房刺激性不大，30 mL、60 mL劑量均安全，所以每個(gè)乳區(qū)注射劑量在100 mL以下均可作為以后治療的劑量篩選參考。

表7　給藥后不同乳區(qū)臨床癥狀的變化Table 7Mammary change of different clinical symptoms after administration

表8　100ml組給藥前后乳汁體細(xì)胞數(shù)差異表達(dá)量Table 8Differences expression of somatic number 100 mL of milk several around administration

3　討論

奶牛乳房炎是由病原微生物侵入、物理性刺激及機(jī)械性損傷所致，以乳房實(shí)質(zhì)、間質(zhì)發(fā)生炎癥為主要癥狀的一種奶牛?；技膊6]。目前抗菌是我國治療各種類型乳房炎的主要方法。常用的抗菌藥物包括青、鏈霉素、頭孢菌素、紅霉素類、地塞米松慶大霉素、四環(huán)素、喹諾酮類、磺胺類等，給藥方式包括全身給藥和乳房局部給藥?？股厥侨榉垦字委煹某Ｒ?guī)藥物，但是由于抗生素在治療乳房炎中的不合理利用，抗生素的諸多缺點(diǎn)越來越突出，比如抗生素在乳腺的分布較差；導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的形成；引起乳腺的免疫機(jī)能下降等[7-11]。

隨著中藥治療奶牛乳房炎研究的不斷深入，中藥劑型選擇的合理性也在不斷完善。目前，用來防治奶牛乳房炎的中藥劑型主要被制成散劑、新型乳房透皮劑、乳房注射劑等。乳房注射劑就是將藥物與合適的溶劑或分散介質(zhì)通過現(xiàn)代工藝制成的用于乳管注入的無菌制劑，可以為溶液、乳狀液、混懸液等型，這種給藥方式方便迅速，最大可能的降低了藥物有效成分的損失[3]?；鞈乙盒褪且环N緩釋制劑，緩釋制劑用于注射時(shí)不僅使用方便，用藥一次更可維持?jǐn)?shù)日，從而提高工作效率。藥物在乳區(qū)內(nèi)可以分布均勻，釋放均勻，可維持較長時(shí)間的藥物濃度，獲得平穩(wěn)持久療效。

由于受到多方面因素如藥物的品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)、處方組成、提取方法、藥物劑量以及給藥途徑等影響，所以中藥并非無毒副作用，因此對中藥制劑進(jìn)行安全試驗(yàn)是必不可少的。實(shí)驗(yàn)中自制的中藥混懸型乳房注射劑是用于治療奶牛乳房炎的一種純中藥制劑，根據(jù)其劑型和給藥途徑進(jìn)行了熱原性、溶血性、過敏性、刺激性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該中藥混懸型注射劑熱原測定符合規(guī)定；對家兔皮膚致敏率為0%，屬于弱致敏物，符合臨床用藥規(guī)定；對家兔腿部肌肉無明顯刺激性；對小鼠未產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)；對健康奶牛乳房刺激性試驗(yàn)證明該中藥混懸型乳房注射劑對奶牛乳房的刺激性與生理鹽水刺激程度相同，證明此中藥注射劑對奶牛乳房刺激性不大。以上結(jié)果證明該中藥混懸型乳房注射劑符合臨床用藥安全性。

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Safety Study of Self-made Chinese Medicinal Herbs Suspension Injection for Dairy Cattle with Mastitis

Li Shiying，Zou Xiao，Xu Qiyou，Liu Yao，F(xiàn)u Shixin （College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Abstract:In order to test the safety of suspension breast injection of self-made chinese medicinal herbs，the temperature sensitivity，haemolyticus，irritation，sensitization，acute toxicity and udder irritation were researched to provide evidence for the clinical use.The results showed that the injection was in line with animal safety use，which provided the basis for clinical safe use of suspension injection.

Key words：dairy cattle；mastitis；chinese medicinal herbs suspension injection；safety；experiment

中圖分類號：S8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2090（2016）01-0019-06

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.005

收稿日期：2015-03-04

作者簡介：李詩瑩（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2013級碩士研究生。

通訊作者：付世新，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：fushixin@163.com。