王軍強 汪晶晶 王琦 馬桂珍 暴增海 王淑芳 周向紅

（淮海工學院化工學院，連云港 222005）

海洋細菌L1-9雙抗菌株的定殖能力及其對黃瓜枯萎病的防治作用

王軍強 汪晶晶 王琦 馬桂珍 暴增海 王淑芳 周向紅

（淮海工學院化工學院，連云港 222005）

采用抗生素標記法，對海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株進行標記，抗性菌株L1-9Str，rif對鏈霉素和利福平的抗性濃度分別為160 μg/mL 和20 μg/mL。雙抗菌株L1-9Str，rif的抑菌特性及其對鏈霉素和利福平的抗性經(jīng)多次傳代仍比較穩(wěn)定。盆栽試驗表明，該雙抗菌株能在黃瓜根部土壤及根組織、莖基部、子葉和真葉組織中定殖。菌株L1-9Str，rif在黃瓜外根際、根際和根表土壤及黃瓜組織中的定殖動態(tài)基本一致，初期黃瓜組織中L1-9Str，rif菌量較少，隨著時間的延長，菌量逐漸增加，達到高峰后逐漸減少。菌株L1-9Str，rif在根表土壤中菌量最多（1.76×109CFU/g），其次是根際土壤，外根際土壤中菌量較少；在黃瓜組織中，菌株L1-9Str，rif其在子葉中的定殖能力最強（5.63×104CFU/g），其次是根和莖基部（0-2 cm）；調查至第26 d時在根部土壤中的含菌量仍保持在穩(wěn)定的水平，其中根表土壤中含菌量最高（2.41×107CFU/g），在黃瓜組織樣品中，子葉中的含菌量最高（4.15×104CFU/g）；溫室防病實驗結果表明，菌株L1-9和L1-9Str，rif菌株對黃瓜枯萎病具有良好的防治效果，不同時期防效均達70 %以上。上述結果表明來自海洋的多黏類芽孢桿菌L1-9菌株能在黃瓜根部土壤及幼苗組織中定殖，是一株有潛力的黃瓜枯萎病生防菌株。

海洋細菌；多黏類芽孢桿菌；抗生素標記；黃瓜枯萎?。欢ㄖ?/p>

應用有益微生物防治植物病害因其環(huán)保、安全、無副作用等優(yōu)點，已成為植物病害防治的重要手段，芽孢桿菌培養(yǎng)周期短，易發(fā)酵獲得而日益成為生防菌的優(yōu)勢菌源［1］。已報到的生防芽孢桿菌種類主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）等［2］。但不同菌株的定殖能力不同，具有較好的定殖能力是生防微生物發(fā)揮生防作用的重要條件之一，其定殖能力的強弱決定著生防作用的大?。?，4］。本課題組從連云港海域海泥中分離得到的多黏類芽孢桿菌L1-9菌株及其發(fā)酵產(chǎn)物對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）等多種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有強烈的抑制作用，對小麥根腐霉病和番茄早疫病的防病效果明顯，而對大豆、小麥、黃瓜等作物的種子發(fā)芽、出苗和以及幼苗生長安全，表現(xiàn)出了良好的開發(fā)應用前景［5-7］，但該菌株分離自海洋環(huán)境，能否在土壤中定殖是發(fā)揮生防效果的關鍵。

對環(huán)境中的目標生防菌進行定殖檢測是檢驗其生防潛力的有效方法，其中抗生素標記法［8，9］已成為研究生防菌在土壤和植物體內(nèi)定殖規(guī)律的一種簡便、經(jīng)濟的方法。該方法一般不會導致原始菌株重要特性的改變。楊洪鳳等［10］、王靜等［11］采用抗利福平標記法研究了內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）CC09菌株和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）AR03在小麥葉部和煙草根部及根際土壤中的定殖規(guī)律；游春平等［12］使用利福平和青霉素雙抗標記法證明拮抗細菌Bio-d5在香蕉土壤中有較好的定殖能力。有關來自于海洋的生防菌株的定殖規(guī)律尚未見報道。為了探討來自海洋生防菌株在環(huán)境中的定殖規(guī)律及其生防效果，本研究通過盆栽試驗測定海洋多粘類芽孢桿菌對黃瓜枯萎病的防病效果，采用雙抗標記法明確來自海洋的生防多粘類芽孢桿菌L1-9菌株在黃瓜根及莖、葉內(nèi)的定殖情況，旨在為研究海洋細菌L1-9菌株的生防作用機理和效果評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種和培養(yǎng)基 多黏類芽孢桿菌（P. polymyxa）L1-9由本實驗室從連云港海域潮間帶海泥中分離獲得并保存。供試病原真菌黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供，本實驗室保藏。

1.1.2 L1-9菌株培養(yǎng)保藏和抗藥性菌株的篩選 培養(yǎng)基為海水配制的PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，用海水定容至1 L；L1-9種子液和和發(fā)酵液的制備培養(yǎng)基為PD：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，用海水定容至1 L；病原真菌活化及抑菌試驗用培養(yǎng)基為淡水配制的PDA培養(yǎng)基；黃瓜枯萎病菌擴繁培養(yǎng)基為麥粒砂培養(yǎng)基：麥粒40 g，水60 mL，砂100 g，pH自然。

1.1.3 抗生素及其溶液的配制 鏈霉素和利福平購自上海英濰捷基生物技術有限公司。稱取鏈霉素適量，置于棕色試劑瓶中，在超凈臺無菌條件下加入適量無菌水溶解，用孔徑為0.22 μm 的濾膜過濾，配制成200 mg/mL鏈霉素母液。同樣稱取一定量的利福平，于棕色試劑瓶中加入二甲基亞砜溶解，用孔徑0.22 μm 的濾膜過濾，配制成50 mg/mL利福平母液，整個過程在黑暗條件下進行。將配好的鏈霉素、利福平溶液裝入EP管中，避光4℃密封保存。

1.1.4 黃瓜種子及土壤 黃瓜種子：津春四號，購自連云港市新浦區(qū)種子站佳園種子公司。土壤：取自連云港市花果山腳下新華村種植黃瓜土壤耕作層，過篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜枯萎病菌接種物的制備 裝有200 g麥粒砂培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中接種培養(yǎng)4 d、直徑5 mm的黃瓜枯萎病菌菌苔6塊，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，粉碎按1∶1比例與無菌細砂混勻，即為黃瓜枯萎病菌接種物［13］。

1.2.2 海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株抗鏈霉素和利福平標記 將液體培養(yǎng)24 h的L1-9菌株稀釋涂布在含有5 μg/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，長出的單菌落再以同樣的方法，接種到含有10 μg/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，逐步提高鏈霉素的濃度，直到L1-9菌株不能生長，篩選出抗最高濃度鏈霉素的L1-9菌株突變菌株。采用同樣的方法，將篩選出的抗最高濃度鏈霉素的L1-9菌株依次接種在含高濃度鏈霉素，并同時加入不同濃度利福平的PDA培養(yǎng)基上，篩選出同時抗高濃度鏈霉素和高濃度利福平的L1-9雙抗菌株，在雙抗培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)10代，測定雙抗菌株的抗菌作用傳代穩(wěn)定性。

平板對峙培養(yǎng)法測定L1-9菌株的雙抗菌株對禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、小麥根腐菌（B. sorokiniana）及黃瓜枯萎菌（F. oxysporum）等植物病原真菌的抑制作用，并測定雙抗菌株的抗性傳代穩(wěn)定性。

1.2.3 L1-9標記菌株發(fā)酵液的制備 L1-9標記菌株在含鏈霉素和利福平的PDA斜面上培養(yǎng)24 h后，用PD培養(yǎng)液洗下菌苔，制備濃度為5 ×108CFU/mL 的菌懸液作為種子液，按8%的接種量接種到裝有50 mL含鏈霉素和利福平的PD培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，在轉速180 r/min，28℃下振蕩培養(yǎng)24 h，制備成濃度為109CFU/mL的菌懸液［13］。

1.2.4 標記菌株L1-9Str，rif在土壤和黃瓜根、莖、葉組織中的定殖及防病效果 采用室內(nèi)盆栽試驗的方法，L1-9標記菌株和原始菌株發(fā)酵液分別與土壤混和，使土壤中L1-9標記菌株和原始菌株的含量為109CFU/g，分別為處理1和處理2，以等量的L1-9標記菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基為對照1（CK1）和對照2（CK2），每個口徑為10 cm的營養(yǎng)缽裝土200 g，播種黃瓜種子5粒，采取上覆下墊方式接種黃瓜枯萎病菌接種物5 g，每個處理和對照播種50盆，播種當天開始，每隔3 d取黃瓜根際、外根際和根表土壤以及黃瓜根組織、莖、子葉和真葉組織，每次取黃瓜5株。采集根際土及根表土參考涂璇等人的方法［14］。

1.2.4.1 根際土 將同一處理的黃瓜幼苗輕輕拔起，稍微抖動下，使根上大塊土壤脫落，用無菌紙包裹，輕輕揉搓，使依附在根上的土壤落在無菌紙上，充分混勻后即為根際土。

1.2.4.2 根表土及根組織 將取過根際土的黃瓜根系剪下，稱質量為m1，后放入裝有石英砂和99 mL無菌水的三角瓶中，在搖床上室溫振蕩30 min后取出根系，用吸水紙將其周圍的水分吸干后，稱得質量為m2，即為根系的質量。根表土的質量m=m1-m2。

采用含有鏈霉素和利福平的PDA平板對抗性菌株進行回收，分別測定各樣品中L1-9標記菌株的菌落數(shù)。出苗1周后開始，每隔6 d調查黃瓜枯萎病的發(fā)病率，計算防病效果。

防病效果=（對照的發(fā)病率-處理的發(fā)病率）/對照的發(fā)病率*100%。

2 結果

2.1 L1-9菌株的抗性標記

2.1.1 抗鏈霉素菌株的篩選 L1-9菌株在鏈霉素濃度為0-100 μg/mL的PDA平板上生長較好，菌落密集；濃度為120-150 μg/mL時，菌落較稀疏，出現(xiàn)了單菌落，濃度為160-180 μg/mL時，出現(xiàn)明顯的單菌落，平板上的數(shù)量在10以下，鏈霉素濃度高于180 μg/mL時，L1-9菌株不能生長，結果見表1。

表1 L1-9菌株在不同濃度鏈霉素平板上的生長情況

將在濃度為160-190 μg/mL鏈霉素的平板上生長的L1-9菌株單菌落接種到含有高濃度鏈霉素的平板上連續(xù)培養(yǎng)，觀察不同時間L1-9菌株的生長情況。實驗結果表明在鏈霉素濃度為190 μg/mL時無菌落長出，濃度為180 μg/mL時，培養(yǎng)24 h和48 h無菌落長出，培養(yǎng)72 h有少量L1-9菌株菌落長出，菌落較小，生長較弱；在鏈霉素濃度為160和170 μg/mL的平板上，L1-9菌株在48 h長出較好菌落，連續(xù)觀察菌落生長相對穩(wěn)定。 因此，選擇鏈霉素濃度為160 μg/mL作為L1-9菌株抗鏈霉素最佳濃度，用于進行抗利福平菌株的篩選。

2.1.2 抗鏈霉素 L1-9菌株抗利福平的篩選 抗鏈霉素濃度為160 μg/mL的L1-9菌株在含有不同濃度利福平的平板上，隨著利福平濃度增加長出的菌落數(shù)量明顯減少，利福平濃度為10、15、20 μg/mL的平板上L1-9菌株生長良好，利福平濃度高于20 μg/mL時L1-9菌株不能生長。通過抗生素濃度梯度篩選得到的L1-9菌株雙抗菌株命名為L1-9Str，rif，對鏈霉素和利福平的抗性濃度分別為160 μg/mL和20 μg/mL。

2.1.3 雙抗菌株L1-9Str，rif的抗藥、抑菌和傳代穩(wěn)定性 L1-9Str，rif菌株在雙抗培養(yǎng)基上連續(xù)轉接傳代10次，仍然生長良好，生長特性穩(wěn)定，與原始菌株無差別；不同轉接代數(shù)對供試的禾谷鐮刀菌、小麥根腐病菌和黃瓜枯萎病菌具有較強抑制作用，抑菌帶寬度無明顯差異（表2）。表明L1-9Str，rif菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可用于后續(xù)定殖研究。

表2 雙抗菌株L1-9Str，rif連續(xù)轉接10代對不同病原真菌的抑菌帶寬度（mm）

2.2 L1-9Str，rif菌株對黃瓜枯萎病的防治作用

從表3可以看出，標記菌株L1-9Str，rif和原始菌株L1-9在不同調查時期對黃瓜枯萎病均有較好的防病效果，防效均高于70 %，兩菌株對黃瓜枯萎病的防病效果無明顯差別。

表3 L1-9雙抗菌株對黃瓜枯萎病的防治作用

2.3 L1-9Str，rif菌株在黃瓜根際土壤和組織中的定殖

2.3.1 在黃瓜根部土壤中的定殖 用 L1-9原始菌株處理土壤的處理2以及相應的L1-9Str，rif菌株發(fā)酵培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基對照組（CK1和CK2）處理的土壤，在雙抗平板上均未分離到L1-9菌株；用L1-9雙抗菌株發(fā)酵液處理土壤的處理1，在黃瓜幼苗根系的各部位土壤中均分離到了L1-9菌株，說明L1-9菌株已被成功標記，且雙抗菌株可用于海洋細菌L1-9菌株定殖規(guī)律研究。

從圖1可以看出，L1-9Str，rif菌株在根際、外根際和根表的定殖趨勢不同。總體根表土壤中的菌量最高，可達1.76×109CFU/g，其次是根際土壤，外根際土壤中的菌量較少。接種后0-7 d 的根際、外根際和根表土壤中L1-9Str，rif菌株的數(shù)量明顯下降，但7 d后根表土壤的菌量開始增加，第10天菌量達到最高，為1.76×109CFU/g，其后開始減少，第23天菌量較少；與根表相比，根際和外根際土壤中標記菌株的數(shù)量增加較為緩慢，從10 d后才有所增加，第13天菌落數(shù)才得到最高，分別為2.88×108CFU/g和8.24×107CFU/g，其后逐漸減少。

圖1 雙抗菌株L1-9Str，rif在黃瓜土壤中的定殖規(guī)律

2.3.2 在黃瓜組織中的定殖 從圖2可知，從不同時期的黃瓜根、莖基部組織中均可以檢測到L1-9Str，rif，在不同部位黃瓜組織中的定殖趨勢類似。0-4 d不同部位組織的菌量較小，4 d后逐漸增加，至第13天、16天、20天根、子葉和莖（0-2 cm）中的菌量分別達到最高，分別為1.61×104CFU/g，5.63×104CFU/g，1.89×104CFU/g，隨后開始緩慢下降，隨后趨于平穩(wěn)。至第23天，L1-9Str，rif菌株在子葉中的含菌量仍然保持較高水平，說明L1-9Str，rif菌株在黃瓜組織中具有好的定殖能力。但L1-9Str，rif在不同組織中的菌量和達到高峰的時間明顯不同。L1-9Str，rif在子葉中的菌量最高，其次是根和莖基部0-2 cm組織，在莖基部2-4 cm組織中較少，在真葉的含菌量最低。

圖2 不同時期黃瓜組織樣品中L1-9菌株的分離結果

3 討論

生防菌能在根圍成功定殖是發(fā)揮生防作用的第一步，只有能夠在土壤和植物根部中定殖的生防菌才能在實際生產(chǎn)中具有使用意義。生防菌的定殖能力與其自身遺傳學特性和根部的分泌物相關，同時受植物和土著微生物種類及根際復雜的土壤環(huán)境等因素影響［15］。研究生防菌在植物根部的定殖能力，有助于認識生防細菌的作用機制，提高生防細菌的防治效果。

趙新海等［16］研究發(fā)現(xiàn)多黏類芽孢桿菌LICC 10427在黃瓜葉面和土壤中第5天達到最大定殖量，分別為2.3×106CFU/g和1.6×107CFU/g，在20-30 d抗性菌株的數(shù)量基本上趨于穩(wěn)定，分別保持在0.9×106CFU/g和0.9×107CFU/g。海洋細菌L1-9菌株在根表土壤，根際土壤和外根際土壤中菌量最高分別為1.76×109CFU/g，2.88×108CFU/g和8.24×107CFU/g明顯多于LICC 10427菌株在土壤中的定殖量；而根、子葉和莖基部（0-2 cm）等黃瓜組織中的菌量最高分別為1.61×104CFU/g，5.63×104CFU/g和1.89×104CFU/g比LICC 10427菌株在黃瓜葉面的定殖量小，定殖量不同可能與環(huán)境和拮抗菌自身因素有關。本研究結果顯示至第26天時L1-9菌株在根部土壤中保持在相對穩(wěn)定的水平，其中根表土壤中含菌量最高（仍可達2.41×107CFU/g），在黃瓜組織樣品中，子葉的含菌量最高（4.15×104CFU/g），與LICC 10427菌株的定殖結果相一致，都在20 d后定殖量基本上趨于穩(wěn)定。

黃瓜枯萎病是一種維管束病害，枯萎病菌從根部侵染黃瓜，然后沿維管束向上轉移，因此該病害是一種比較難防治的病害。鐮刀菌非致病株F047之所以具有較高的防效，其中一個重要原因就是該菌株可在植株內(nèi)定殖，并且具有和枯萎病菌一樣的生態(tài)位點，競爭枯萎病菌的營養(yǎng)和生態(tài)位點，從而抑制病原菌的擴展［17］。許多內(nèi)生菌，如拮抗菌biod5、內(nèi)生菌01-144和內(nèi)生菌BPT-18不僅能在植物表面的附著位點擴展、繁殖，而且能在植物體內(nèi)轉移，并對特定部位有所偏好，表現(xiàn)出較強的親和定殖能力，對維管束病害表現(xiàn)出良好的防治作用［18，19］。

本研究中海洋細菌L1-9菌株不僅可以在黃瓜根部土壤中很好定殖，而且可以在黃瓜組織中定殖，并隨著植株的生長從根向莖、葉轉移，表明海洋細菌L1-9菌株具有較強的定殖能力和環(huán)境適應性。該菌株對黃瓜枯萎病防治效果也比較明顯（可達70%）。關于海洋細菌L1-9菌株在田間環(huán)境條件下的適應性和對黃瓜枯萎病的防治效果尚需進一步明確。

4 結論

海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株能在黃瓜根部土壤及幼苗組織中定殖，在根部土壤中根表土壤含菌量最高，第7天達最大1.76×109CFU/g，在其根、莖基部和子葉等幼苗組織中子葉的含菌量最高，第16天達最大為5.63×104CFU/g；至第26天時在根部土壤中的含菌量仍保持在較高的水平，其中根表土壤中含菌量最高（2.41×107CFU/g），在黃瓜組織樣品中，子葉中的含菌量最高（4.15×104CFU/g）；對黃瓜枯萎病具有較高的防治效果，達70 %以上，是一株有潛力的黃瓜枯萎病生防菌株。

［1］易龍, 張亞, 廖曉蘭, 等. 蠟狀芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物的研究進展［J］. 農(nóng)藥, 2013, 52（3）：162-164.

［2］ 葉晶晶, 曹寧寧, 吳建梅, 等. 生防芽孢桿菌的應用研究進展［J］. 西北農(nóng)林科技大學學報, 2014, 42（8）：185-190.

［3］Benizri E, Baudoin E, GuckerL A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria［J］. Biocontrol Science and Technology, 2001, 11（5）：557-574.

［4］Alabouvette C, Olivain C, Steinberg C. Biological control of plant diseases：the European situation［J］. European Journal of Plant Pathology, 2006, 114（3）：329-341.

［5］馬桂珍, 王淑芳, 暴增海, 等. 海洋細菌L1-9菌株對小麥的促生防病作用研究［J］. 中國生物防治學報, 2011, 27（2）：228-232.

［6］馬桂珍, 付泓潤, 王淑芳, 等. 海洋多黏類芽孢桿菌 L1-9 菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性測定［J］. 海洋通報, 2013, 32（3）：316-320.

［7］馬桂珍, 王淑芳, 暴增海, 等. 海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株抗菌蛋白的分離純化及其抗菌作用［J］. 食品科學, 2010, 31（17）：335-339.

［8］Compant S, Clement C, Sessitsch A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo and endosphere of plants：their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization［J］. Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42：669-678.

［9］Compant S, Duffy B, Nowak J, et al. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases：principles, mechanisms of action, and future prospects［J］. Applied and Environmental Miorobiology, 2005, 71（9）：4951-4959.

［10］楊洪鳳, 薛雅蓉, 余向陽, 等. 內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09菌株在小麥葉部的定殖能力及其防治自粉病效果研究［J］. 中國生物防治學報, 2014, 30（4）：481-488.

［11］王靜, 常平, 孔凡玉, 等. 拮抗細菌AR03在煙草根部及根際土壤中的定殖與鑒定［J］. 中國煙草科學, 2010, 31（3）：45-48, 53.

［12］游春平, 劉任, 肖愛萍, 等. 拮抗細菌Bio-d5在香蕉根部定殖能力的測定［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, 27（3）：363-366.

［13］王希, 暴增海, 馬桂珍, 等. 海洋多黏類芽孢桿菌L1-9菌株對黃瓜的促生作用和誘導抗性研究［J］. 北方園藝, 2014（21）：133-137.

［14］涂璇, 薛泉宏, 張寧燕, 等. 辣椒疫病生防放線菌篩選及其對辣椒根系微生物區(qū)系的影響［J］. 西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版, 2007, 35（6）：141-146.

［15］張炳欣, 張平, 陳曉斌. 影響引入微生物根部定殖的因素［J］.應用生態(tài)學報, 2000, 11（6）：951-953.

［16］趙新海, 鐘麗娟, 張慶華, 等. 多黏類芽孢桿菌在黃瓜葉面和土壤中定殖能力及其對土壤微生物的影響［J］. 世界農(nóng)藥, 2009, 31（5）：25-27.

［17］張琴芳, 代光輝, 顧振芳, 等. 非致病性鐮刀菌Fusarium oxysporum菌株FO47對番茄枯萎病的防治效果［J］. 上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版, 2004, 22（1）, 17-21.

［18］龍良鯤, 肖崇剛. 內(nèi)生細菌01-144在番茄根莖內(nèi)定殖的初步研究［J］. 微生物學通報, 2003, 30（5）：53-56.

［19］張鐸, 陶秀娥, 梁艷, 等. 黃瓜枯萎病拮抗內(nèi)生菌BPT-18的鑒定及抗菌物質的性質［J］. 農(nóng)藥, 2012, 51（6）：464-467.

（責任編輯 李楠）

Colonization of Double-resistance Strain of Marine Bacterium L1-9 and Its Biocontrol Effect on Fusarium Wilt of Cucumber

WANG Jun-qiang WANG Jing-jing WANG Qi MA Gui-zhen BAO Zeng-hai WANG Shu-fang ZHOU Xiang-hong
（School of Chemical Engineering，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005）

The Paenibacillus polymyxa strain L1-9 of marine bacterium was labeled by antibiotic marker，and strain L1-9Str，rifshowed the resistance to rifampicin and streptomycin at the concentrations of 160 μg/mL and 20 μg/mL，respectively. The antibacterial characters of doubleresistance strain L1-9Str，rifand its resistance to rifampicin and streptomycin were still stable after 10 times subculturing. The pot experiment showed that L1-9Str，rifsuccessfully colonized in cucumber rhizosphere soil，root tissue，stem base，cotyledon，and true leaves. The colonized dynamics of L1-9Str，rifin cucumber ecto-rhizosphere soil，rhizosphere and rhizoplane soil，and cucumber tissues were similar；the amount of L1-9Str，rifcolonized in cucumber tissue was little in the early stage，but increased gradually along with the cucumber growth，and reached a peak，then decreased gradually. The amount of L1-9Str，rifwas the most in rhizoplane soil（1.76×109CFU/g），the followed in the rhizosphere，while the least in ecto-rhizosphere soil. The detection of L1-9Str，rifin cucumber tissues showed that it was the most in cotyledons（5.63×104CFU/g），followed by its number in roots and stem bases（0 - 2 cm）. The amount of bacteria in the rhizosphere soil was still in a stable level at 26 d，and the quantity from rhizoplane soil was the highest with 2.41×107CFU/g. The quantity of bacteria in the cotyledons got the highest of 4.15×104CFU/g among cucumber tissue samples. The greenhouse test showed that both strain L1-9 and strain L1-9Str，rifhad favorable control effects onfusarium wilt of cucumber with the control efficacy over 70% at different stages. The above results indicated that strain P. polymyxa strain L1-9 may colonize in cucumber rhizosphere soil and tissues，and present a great potential for the bio-control of fusarium wilt of cucumber.

marine bacteria；Paenibacillus polymyxa；antibiotic marker；fusarium wilt of cucumber；colonization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.028

2015-09-16

江蘇省自然科學基金項目（BK20141248），江蘇省高校自然科學重大項目（12KJA210001），連云港市科技局農(nóng)業(yè)攻關項目（CN1307），國家級大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目（G201411641105002），江蘇省“十二五”高等學校水產(chǎn)類重點專業(yè)項目資助

王軍強，男，研究方向：生物化工；E-mail：873941442@qq.com

馬桂珍，女，博士，教授，研究方向：抗菌微生物及植物病害生物防治；E-mail：guizhenma@sohu.com