李楊李河周國英劉君昂

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004）

油茶新炭疽病原Colletotrichum camelliae鑒定及致病性測定

李楊1，2李河1，2周國英1，2劉君昂1，2

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004）

油茶炭疽病菌能夠侵染油茶葉片、花及果實(shí)，造成嚴(yán)重落葉、落果，該病害是我國油茶最重要的病害之一。對(duì)采集于湖南、江西及海南的油茶炭疽病的病原菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察及多基因序列分析，同時(shí)對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行不同品種油茶致病性測定，結(jié)果表明，分離到的5株病原菌為山茶刺盤孢Colletotrichum camelliae，這是國內(nèi)首次在油茶上發(fā)現(xiàn)該病原菌。經(jīng)C. camelliae對(duì)不同油茶品種致病性測定，發(fā)現(xiàn)C. camelliae對(duì)湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)、長林190號(hào)等品種的葉片致病，但是在不同品種葉片上出現(xiàn)癥狀的時(shí)間不同。

油茶；山茶刺盤孢；炭疽?。欢嗷蛐蛄?；致病性

油茶（Camellia oleifera Abel）主要是指山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia L.）植物中油脂含量較高且具有栽培經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類植物的總稱［1］，是原產(chǎn)于我國的食用木本油料樹種。袁嗣令等［2］發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病可以引起油茶落花、落果，給茶農(nóng)帶來極其嚴(yán)重的損失。近幾十年來，國內(nèi)植物病害學(xué)者對(duì)油茶炭疽病做了大量的研究，普遍認(rèn)為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）是引起油茶炭疽病的病原菌［3-12］。但是，隨著多基因序列鑒定病原菌方法的引入，可將形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分的新種鑒定并從復(fù)合種中分離出來，大大提高了對(duì)炭疽屬真菌鑒定的準(zhǔn)確率。例如，張海英等［13-16］通過形態(tài)學(xué)觀察及單基因序列分析，將中國草莓炭疽病的主要病原物鑒定為膠孢炭疽菌，而韓永超等［17］通過ACT、TUB2和CAL三個(gè)基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將武漢地區(qū)草莓根頸腐爛病的病原鑒定為膠孢炭疽菌復(fù)合種內(nèi)的C. siamense［18］；楊友聯(lián)等［19］采用多基因譜系方法將膠孢炭疽菌復(fù)合種劃分成22個(gè)種和1個(gè)亞種；楊友聯(lián)結(jié)合形態(tài)學(xué)及多基因系統(tǒng)學(xué)，將采自中國貴州、云南、廣西等省的190株炭疽菌屬菌株確定為22個(gè)分類單元。李河等［20-22］利用形態(tài)學(xué)觀察及多基因分析方法，發(fā)現(xiàn)油茶炭疽病的病原除了膠孢炭疽菌外，還有果生刺盤孢菌（Colletotrichum fructicola）、暹羅刺盤孢菌（Colletotrichum siamense）及博寧炭疽菌（Colletotrichum boninense）。因此，有必要對(duì)油茶炭疽病致病菌進(jìn)行進(jìn)一步的研究，另外，油茶炭疽病菌對(duì)不同品種油茶致病性的研究在國內(nèi)也鮮見報(bào)道。我們從湖南、江西及海南油茶產(chǎn)區(qū)采集病葉，對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化，通過形態(tài)學(xué)觀察并結(jié)合多基因序列分析方法，發(fā)現(xiàn)炭疽屬的山茶刺盤孢（C. camelliae）也可以使油茶致病，并進(jìn)行該菌對(duì)湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)、長林190號(hào)等12個(gè)品種油茶致病性的測定，旨在為防治該病菌引起的病害提供理論依據(jù)。

表1 引物及其退火溫度

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 于2014年10月從湖南瀏陽市、江西長埠鎮(zhèn)及官山林場采集典型油茶炭疽病病葉，2015年4月從海南澄邁林場采集典型油茶炭疽病病葉。

1.1.2 培養(yǎng)基［23］PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。SNA培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1.0 g，硝酸鉀1.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂14 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑 DNA快速提取試劑盒Fast DNA Kit，美國MPBIO公司；2×Taq PCRMaster Mix，天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 儀器 ABI 9700 PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；快速核酸提取儀，美國MPBIO公司；5145D離心機(jī)，德國Eppendoff公司；Nikon 80I顯微鏡，NIKON儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及純化 采用常規(guī)組織分離方法［23］進(jìn)行病原菌分離和純化。分離得到的菌株于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌生物學(xué)鑒定 將菌株接種在PDA及SNA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)10 d，每天觀察記錄菌落形態(tài)，并測量菌落直徑。光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子和附著孢形態(tài)，并測量分生孢子大小。

1.2.3 病原菌DNA的提取、擴(kuò)增及核苷酸序列測定 將純化好的菌株接種至PDA平板，28℃培養(yǎng)7 d，用無菌牙簽刮取適量菌絲放入1.5 mL離心管中，采用夏花等［24］的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行病原菌DNA的提取?；蜻x擇及目的片段擴(kuò)增與測序參照Weir等［18］的方法、反應(yīng)體系及條件，實(shí)驗(yàn)所用引物及相關(guān)內(nèi)容見表1。PCR產(chǎn)物委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 使用ClustalW軟件對(duì)測序獲得的3個(gè)基因分別進(jìn)行比對(duì)和手工校正，然后按照ITS-CAL-GAPDH的順序分別首尾相連，并下載GenBank中同時(shí)含有上述3個(gè)基因序列的炭疽屬菌株的序列，按照ITS-CAL-GAPDH的順序首尾相連后進(jìn)行同源性分析，用軟件MEGA6.0構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 致病性測定 選用湖南省種植廣泛的油茶品種“湘林1號(hào)”進(jìn)行病原菌的致病性測定。用無菌牙簽蘸取分離到的5個(gè)菌株（編號(hào)見表2）的分生孢子懸浮液（105個(gè)/mL）后刺扎油茶葉，CK組用無菌水處理，置于室外套袋保濕培養(yǎng)，每個(gè)菌株接種30個(gè)葉片，CK組處理30個(gè)葉片。每天觀察葉片發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病葉片再進(jìn)行病原菌分離及與接種病原菌進(jìn)行形態(tài)特征比較。

表2 分離菌株編號(hào)及其GenBank登錄號(hào)

圖1 炭疽菌菌株（CMHNYC15）的形態(tài)特征

1.2.6 病原菌對(duì)不同品種油茶致病性測定 為了明確分離到的病原菌對(duì)不同品種油茶的致病性，對(duì)湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)、長林190號(hào)等12個(gè)品種（兩年生）葉片進(jìn)行活體接種。接種方法同1.2.5。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

從湖南、江西及海南三省油茶產(chǎn)區(qū)分離到5株形態(tài)特征疑似炭疽病原菌的菌株（編號(hào)分別為HNLY6-2、HNLY6-3、JXGS-B8、JXCB21、CMHNYC15），5個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基上形態(tài)特征相似（圖1），培養(yǎng)7 d時(shí)，菌落直徑約為6.5 cm，生長速率約為9.3 mm/d；菌落近似圓形，氣生菌絲稀疏，緊貼培養(yǎng)基，初期為白色，培養(yǎng)7 d后菌落中央由白色漸變?yōu)榛野咨?，菌落邊緣仍為白色；培養(yǎng)10 d時(shí)，黑色素大量沉積，致使整個(gè)培養(yǎng)皿背面變?yōu)楹谏?。在SNA培養(yǎng)基上，分生孢子無色、光滑，單孢，長橢圓形或圓柱形，兩端圓或一端略粗，另一端稍尖，大小為（13±3.5）μm×（3±2）μm；附著孢從菌絲上產(chǎn)生，末端膨大，呈不規(guī)則形狀，顏色較深（圖1）。

2.2 致病性測定

經(jīng)致病性測定發(fā)現(xiàn)，在接種3-4 d后，病原菌可使油茶葉片表現(xiàn)發(fā)病癥狀，病斑初期呈褐色不規(guī)則斑塊，并逐漸擴(kuò)展，漸變?yōu)樯詈稚蚝谏笃诓“叱驶疑?，病斑直?-18 mm（圖2-A）。經(jīng)進(jìn)一步病原菌分離，獲得與接種菌株一致的分離物，表明分離到的菌株為油茶炭疽病的病原菌。

2.3 菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

5個(gè)菌株的編號(hào)及每個(gè)基因的GenBank登錄號(hào)見表2，5個(gè)菌株的ITS-CAL-GAPDH序列與GenBank下載的菌株序列的聚類分析結(jié)果（圖3）顯示，5個(gè)分離菌株與2株C. camelliae聚為一支，自展支持率為95%，能夠與炭疽屬其他種區(qū)分開；其它分支中，炭疽菌屬同種菌株也都以非常高的支持率聚為一個(gè)進(jìn)化枝。結(jié)合菌株形態(tài)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，可將分離到的5株病原菌鑒定為山茶刺盤孢C. camelliae。

圖2 山茶刺盤孢（CMHNYC15）接種不同品種油茶葉片上的癥狀

表3 山茶刺盤孢對(duì)不同品種油茶葉片的致病性（顯癥時(shí)間/d）

2.4 病原菌對(duì)不同品種油茶致病性測定

不同品種油茶葉片接種實(shí)驗(yàn)（表3）表明，C. camelliae均可侵染湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)、長林190號(hào)等品種。其中，湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)及長林190號(hào)等品種上的癥狀類似（圖2）；廣西紅花、贛無1、贛無16品種葉片上形成的病斑不易擴(kuò)展，且10 d后病斑明顯比其他品種小。連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)病菌在不同品種葉片上出現(xiàn)癥狀的時(shí)間（3-10 d）不同（表3）。

3 討論

炭疽屬真菌危害全球多種植物，如谷物、蔬菜、水果等，給農(nóng)民造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。炭疽屬真菌早期主要依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，可用于鑒定的指標(biāo)有分生孢子、附著孢的形狀及大小，以及剛毛、分生孢子梗和產(chǎn)孢細(xì)胞大小，菌核、后垣孢

子的有無及形態(tài)等。Von Arx［25］根據(jù)分生孢子的大小來界定種，將750多個(gè)種合并為11個(gè)種，使得一些種成為復(fù)合種或種群（Species group）；Damm等［26］將分生孢子梗實(shí)際應(yīng)用于分類中，結(jié)合其它形態(tài)特征，很好地界定了草生彎孢類該屬真菌，引進(jìn)了6個(gè)新的分類單元。20世紀(jì)90年代之后，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，ITS序列在該屬真菌分子系統(tǒng)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，為很多物種的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析提供了有利的工具。例如，C. boninense最初基于形態(tài)特征被鑒定為C. gloeosporioides，而Moriwaki等［27］利用ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)分析，將其獨(dú)立為新的分類單元。然而Avise等［28］指出僅僅依靠ITS序列不能有效地進(jìn)行種的識(shí)別，否則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。此外，Crouch［29］也指出在GenBank所登錄的序列中，約有86%的炭疽屬真菌的ITS序列被錯(cuò)誤定義。Cai等［30］提出采用多基因序列分析來對(duì)炭疽菌進(jìn)行分子鑒定，這在一定程度上提高了對(duì)炭疽屬真菌的鑒定準(zhǔn)確率。例如，Crouch［31］運(yùn)用ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2四個(gè)基因進(jìn)行聯(lián)合分析，對(duì)形態(tài)上極難識(shí)別的集合種C. gramincola區(qū)分開來，恢復(fù)C. cereale和C. eleusinsines為合格種，并引入了6個(gè)新種；Damm等［26］利用ITS、ACT、TUB2、CHSI、HIS3和GAPDH六個(gè)基因序列進(jìn)行分析，將草本植物上的黑線炭疽菌區(qū)分開來，并引入了4個(gè)新種。

圖3 依據(jù)ITS-CAL-GAPDH 3基因合并序列用N-J法構(gòu)建炭疽病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

目前已報(bào)道能侵染油茶的炭疽病原有膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、果生刺盤孢菌C. fructicola、暹羅刺盤孢菌C. siamense及博寧炭疽菌C. boninense。本研究從湖南、江西及海南3個(gè)省市油茶發(fā)病葉上分離到5株菌落形態(tài)特征一致的菌株，但與上述菌相比，在菌落顏色上，C. gloeosporioides、C. fructicola和C. siamense呈淺灰色至深灰色，C. boninense呈奶白色至橘紅色，而分離到的5株菌株菌落初期呈雪白色，7 d時(shí)菌落背面出現(xiàn)黑色素沉積，10 d后菌落漸變?yōu)榛野咨?，整個(gè)菌落背面呈黑色；報(bào)道的油茶炭疽菌的分生孢子堆顏色都為橘黃色，分生孢子形態(tài)橢圓形或圓柱狀、單胞、無色，菌絲附著孢橢圓形或不規(guī)則形，褐色，然而本研究分離的5株菌株在PDA上較難培養(yǎng)出分生孢子及附著孢，在SNA上，分生孢子長橢圓形或圓柱形，兩端圓或一端略粗，另一端稍尖，附著孢形狀不規(guī)則，顏色較深。通過形態(tài)學(xué)觀察及多基因序列分析，將本研究分離到的5株菌株鑒定為山茶刺盤孢C. camelliae。

本研究分離鑒定了一個(gè)新的油茶炭疽病病原——C. camelliae，通過研究C. camelliae對(duì)不同品種油茶致病性測定，發(fā)現(xiàn)C. camelliae對(duì)湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)、長林190號(hào)等品種的葉片致病，但出現(xiàn)病斑的時(shí)間不同，這可能與油茶品種的抗病性有關(guān)。目前國內(nèi)有關(guān)不同油茶品種對(duì)炭疽病抗性的研究報(bào)道較多，楊光道［32］通過林間調(diào)查及室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攸縣油茶、徽州大紅、徽州小紅、舒城大紅4個(gè)品種為抗炭疽病品種，并對(duì)不同油茶品種抗炭疽病機(jī)制進(jìn)行了初步研究；匡蓉琳等［33］對(duì)14個(gè)油茶品種進(jìn)行炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）接種實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶最為抗病，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同油茶品種的抗病性與油茶的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等生理指標(biāo)相關(guān)；楊華等［34］對(duì)廣東省栽培的不同油茶種和品種進(jìn)行林間調(diào)查及室內(nèi)測定，發(fā)現(xiàn)廣寧紅花油茶屬于抗病種類。下一步將從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、分子生物學(xué)及抗性基因角度研究C. camelliae與不同品種油茶的互作機(jī)制，通過研究油茶品種與炭疽菌之間的關(guān)系，獲得抗炭疽病優(yōu)良品種，可為推進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)的健康、快速發(fā)展提供重要的指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究分離純化得到5株可引起油茶炭疽病的致病菌，利用形態(tài)學(xué)觀察及多基因序列分析，將其鑒定為山茶刺盤孢（Colletotrichum camelliae）。同時(shí)進(jìn)行病原對(duì)不同油茶品種致病性測定，發(fā)現(xiàn)可使湘林1號(hào)、湘林69號(hào)、湘林89號(hào)、贛無1、贛無16、廣西紅花、長林3號(hào)、長林4號(hào)、長林23號(hào)、長林53號(hào)、長林148號(hào)、長林190號(hào)等12個(gè)品種的葉片致病，且在不同品種油茶葉片上出現(xiàn)癥狀的時(shí)間不同。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Identification of a New Anthracnose Pathogen Colletotrichum camelliae and Its Pathogenicity Test on Camellia oleifera

LI Yang1，2LI He1，2ZHOU Guo-ying1，2LIU Jun-ang1，2
（1. Key Laboratory for Non-wood Forest of Cultivation and Conservation of Ministry of Education， Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. Hunan Key Laboratory of Forest Protection，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

Anthracnose is one of the most critical diseases of Camellia oleifera in China because it infects the leaves，flowers and fruits of C. oleifera，leading to severe defoliation and pre-mature drop of fruits. Pathogens from anthracnose-diseased C. oleifera leaves collected in Hunan，Jiangxi and Hainan provinces were identified based on morphological observation and multiple-gene sequences，and pathogenicity test was conducted on various cultivars of C. oleifera. The results revealed that isolated pathogens were Colletotrichum camelliae，which is the first report on this pathogen in China. Pathogenicity tests on various cultivars showed that C. camelliae infected the leaves of different C. oleifera cultivars，such as Xianglin-1，Xianglin-69，Xianglin-89，Ganwu-1，Ganwu-16，Guangxi red flower，Changlin-3，Changlin-4，Changlin-23，Changlin-53，Changlin-148，and Changlin-190，however，spot appearances were different on the leaves of different C. oleifera cultivars.

Camellia oleifera；Colletotrichum camelliae；anthracnose；multiple-gene sequences；pathogenicity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.014

2015-07-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170598）

李楊，男，碩士研究生，研究方向：植物病原微生物；E-mail：liyangcsuft@163.com

劉君昂，男，教授，研究方向：植物病原微生物；E-mail：928447959@qq.com