孫衛(wèi)

阻斷Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)大鼠脊髓損傷的治療效果

孫衛(wèi)

目的 探究阻斷Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)大鼠脊髓損傷的治療效果。方法 選取大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型150只，分為假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各50只。假手術(shù)組進(jìn)行椎板切除術(shù)；對(duì)照組進(jìn)行脊髓橫斷損傷，并對(duì)其腹腔注射生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行脊髓橫斷手術(shù)，給予腹腔注射Fasudil。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組的RhoA mRNA明顯降低。同時(shí)還能見(jiàn)到部分纖維以及大量的NF陽(yáng)性纖維穿過(guò)脊髓橫斷部位，并沿其尾端伸長(zhǎng)。結(jié)論 阻斷Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)軸突再生、傳導(dǎo)功能恢復(fù)以及損傷脊髓運(yùn)動(dòng)具有顯著的促進(jìn)作用。

Rho/ROCK信號(hào)；脊髓損傷；大鼠

成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)一旦受到損傷，其軸突不能再生，功能不能恢復(fù)[1]。但是周?chē)膿p傷神經(jīng)可以再生而且功能也能夠恢復(fù)。Rho/ROCK信號(hào)在軸突再生的信號(hào)傳遞中起著重要的中介作用，因此可通過(guò)對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的Rho/ROCK信號(hào)進(jìn)行抑制，進(jìn)而抑制細(xì)胞外生長(zhǎng)因子[2-3]。本研究通過(guò)阻斷Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)大鼠脊髓損傷的治療效果進(jìn)行研究，確定其能否對(duì)軸突再生以及功能恢復(fù)起到促進(jìn)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型150只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。體質(zhì)量170～210g，采用3%的戊巴比妥鈉（30mg/kg）進(jìn)行腹腔麻醉，將背部正中處切開(kāi)，使脊髓T6～T7通過(guò)下行椎板切除術(shù)暴漏在手術(shù)顯微鏡下，再將脊髓完全橫斷，最后將肌肉以及皮膚逐層縫合。

1.2 方法 對(duì)假手術(shù)組大鼠進(jìn)行椎板切除術(shù)；實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠進(jìn)行脊髓橫斷手術(shù)，給予腹腔注射Fasudil（10mg/kg; ROCK抑制劑；成都苑東藥業(yè)有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)H20040117；規(guī)格2mL：30mg/瓶）；對(duì)照組對(duì)大鼠進(jìn)行脊髓橫斷損傷，并對(duì)其腹腔注射生理鹽水。

1.2.1 提取總RNA 在術(shù)后4周，分別選取距脊髓橫斷上處、下處的脊髓組織10mm，與少量的液氮進(jìn)行混合研磨，直至組織變軟，反復(fù)加入少量液氮研磨3次。在室溫條件下，以每50～100mg組織加入1mL Trizol[上海聯(lián)碩生物科技有限公司；貨號(hào)：15596-026（100mL）15596018（200mL）]對(duì)其進(jìn)行配置，放置5min。并采用轉(zhuǎn)速為12000rpm，離心處理5min。將每毫升的Trizol加入200μL氯仿進(jìn)行調(diào)配，隨后振蕩搖勻，在室溫條件下擱置15min。在溫度為4℃的條件下，使用轉(zhuǎn)速12000rpm，離心處理15min。將上層的水相吸出，放入另一離心管。將每毫升的Trizol加入異丙醇0.5mL，混合搖勻，在室溫下，擱置5～10min。在溫度為4℃的條件下，使用轉(zhuǎn)速12000rpm，離心處理10min，將上清吸出，管底則為RNA。將每毫升的Trizol加入75%的乙醇1mL，震蕩離心管，使其沉淀懸浮。在溫度為4℃的條件下，使用轉(zhuǎn)速8000rpm，進(jìn)行離心處理5min，將上清吸出，室溫條件下，實(shí)行晾干或者干燥處理5～10min。在55～60℃條件下，使用焦炭酸二乙酯（上海翊圣生物科技有限公司；產(chǎn)品貨號(hào)：10602ES25；規(guī)格：25mL）50μL進(jìn)行處理，并采用高壓純水RNA溶解，將樣品擱置5～10min。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR 選取1μL0.2mL的總RNA置于離心管，并放入冰浴，加入1μL的RT/Taq MIX、2倍25μL反應(yīng)緩沖液和各1μL的特異上下游引物[2]。通過(guò)加入DEPC—ddH2O直至體積變?yōu)?0μL，采用輕柔振蕩將其混勻。讓其在40℃的條件下反應(yīng)30min，在94℃下進(jìn)行2min保溫處理，將其溫度及時(shí)間由94℃15s變?yōu)?0℃30s，反復(fù)40次，放置在72℃下10min。提取5μLPCR產(chǎn)物和瓊脂糖凝膠電泳2%，進(jìn)行凝膠成像處理，根據(jù)RhoA和β-actin的灰度比值，確定RhoA mRNA的相對(duì)水平。

1.2.3 HE染色和NF免疫熒光染色 手術(shù)4周后，對(duì)剩余實(shí)驗(yàn)大鼠的心臟采用4%多聚甲醛以及4℃生理鹽水進(jìn)行灌注固定，分別選取距脊髓橫斷上處、下處的脊髓組織10mm，放入20%的蔗糖溶液，在4℃條件下，進(jìn)行過(guò)夜保存。使用常規(guī)石蠟對(duì)脊髓組織進(jìn)行包埋，將矢狀位和橫斷位組織進(jìn)行連續(xù)切片，將厚度保證在10μm，對(duì)切片進(jìn)行染色[3]。

將石蠟切片進(jìn)行水化和脫蠟處理，并加入3%的H2O2甲醇溶液，在室溫下孵育10min。每次使用0.01MPBS對(duì)其進(jìn)行清洗5min，反復(fù)3次，加入封閉血清在室溫下封閉放置20min，將封閉液吸出，加入50倍稀釋的相應(yīng)一抗，在4℃下孵育過(guò)夜，使用PBS反復(fù)清洗3次，每次5min，加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育30min，最后再使用PBS反復(fù)清洗3次，每次5min，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA mRNA的表達(dá)對(duì)比 將β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，通過(guò)β-actin和RhoA mRNA的灰度比值，反應(yīng)RhoA mRNA的相對(duì)水平。各組時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組Rho mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)對(duì)比（x±s）

2.2 HE染色比較 假手術(shù)組為正常組織，對(duì)照組脊髓組織出現(xiàn)水腫，而且結(jié)構(gòu)紊亂，殘留的神經(jīng)元相對(duì)較少，有顯著的細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，伴隨大量膠質(zhì)細(xì)胞滋生。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組較輕，殘留的神經(jīng)元相對(duì)較多。

2.3 NF免疫熒光染色比較 假手術(shù)組的脊髓組織軸突分布正常。對(duì)照組的NF排列雜亂，密度較低，而且在空洞區(qū)未發(fā)現(xiàn)NF陽(yáng)性纖維進(jìn)入。實(shí)驗(yàn)組NF排列雜亂，密度較高，在空洞區(qū)有部分纖維穿過(guò)橫斷脊髓，并沿其尾端伸長(zhǎng)。

3 討論

成年哺乳動(dòng)物脊髓損傷，其軸突很難再生。主要原因是由于在局部環(huán)境存在一直軸突再生的抑制因子[4-5]。抑制因子可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)軸突再生進(jìn)行有效抑制。小分子GTP酶Rho能夠與很多分子相互作用，成為信號(hào)蛋白，具有調(diào)整神經(jīng)元形成的作用[6]。當(dāng)Rho酶與GTP結(jié)合后，成為Rho激酶的直接活化因子，能夠和ROCK結(jié)合。激活后的ROCK可將肌球蛋白等多種靶蛋白輕鏈磷酸化，進(jìn)而可以使神經(jīng)元細(xì)胞骨架重新排列[7-8]。因此，Rho激酶是信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要成分。Fasudil是Rho激酶的抑制劑，作用機(jī)制是通過(guò)和ATP競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而有效的抑制了Rho激酶的活性，阻斷了信號(hào)的傳遞[9]。

本研究通過(guò)阻斷Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)大鼠脊髓損傷的治療效果進(jìn)行研究,研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的RhoA mRNA明顯降低。同時(shí)還能見(jiàn)到部分纖維以及大量的NF陽(yáng)性纖維穿過(guò)脊髓橫斷部位，并沿其尾端伸長(zhǎng)。

綜上所述，阻斷Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)軸突再生、傳導(dǎo)功能恢復(fù)以及損傷脊髓運(yùn)動(dòng)具有顯著的促進(jìn)作用。

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Objective To explore the therapeutic effect of blocking Rho/ROCK signal transduction pathway on spinal cord injury in rats. Methods 150 rats were divided into sham operation group, experimental group and control group, 50 rats in each group. The sham operation group was the control group laminectomy; spinal cord injury, and the intraperitoneal injection of normal saline; the experimental group was given intraperitoneal injection of spinal cord transection surgery, Fasudil. Results mRNA RhoA in the experimental group was significantly decreased. At the same time also can see the part of the fiber and a large number of NF positive fibers through the spinal cord transection site, and along its tail elongation. Conclusion Blocking the Rho/ ROCK signal transduction pathway has a significant role in promoting axonal regeneration, functional recovery and spinal cord injury.

Rho/ROCK signal; Spinal cord injury; Rat

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.29.001

江西 330006 江西省人民醫(yī)院神經(jīng)外科 （孫衛(wèi)）