邵淑敏　李　姣　鄒　敏　胡　廉　張　玲

華中科技大學同濟醫(yī)學院計劃生育研究所生殖醫(yī)學中心(武漢,430030)

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·臨床研究·

精子DNA損傷對IVF/ICSI-ET結局影響的回顧性資料分析

邵淑敏李姣鄒敏胡廉張玲*

華中科技大學同濟醫(yī)學院計劃生育研究所生殖醫(yī)學中心(武漢,430030)

摘要目的：探討精子DNA損傷對體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)結局的影響。方法：回顧性分析了初次行常規(guī)IVF和ICSI治療的192例不孕夫婦的臨床資料。分別比較行IVF和ICSI治療時，精子DNA碎片指數(shù)(DFI)≤15%和DFI>15%的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率的差異；并比較DFI>15%時，不同受精方式(IVF或ICSI)對受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率的影響。結果：在IVF或ICSI治療周期中，精子DNA損傷對受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無影響(P>0.05)。在DFI>15%情況下，行IVF治療的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率與行ICSI治療比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結論：精子DNA損傷不影響IVF/ICSI-ET的結局。對于DFI>15%的患者ICSI-ET與IVF-ET的治療結局相似。

關鍵詞體外受精-胚胎移植；精子DNA損傷；流產(chǎn)率

體外受精-胚胎移植技術(IVF-ET)使生育力低或不孕患者獲得了生育的可能，尤其是卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術使越來越多男性不育癥患者獲得后代。然而，研究證實男性不育患者的精子核可能存在潛在異常，精子形態(tài)完整性也與精子DNA完整性不一致，ICSI時人為選擇形態(tài)和活力好的精子并不能確保其遺傳物質(zhì)正常[1]。目前精子DNA損傷成為對精子功能評價的一項新指標，有研究表明精子DNA損傷對IVF-ET結局有一定的影響，但目前尚存爭議[2]。本研究回顧性分析行IVF/ICSI-ET治療的不孕夫婦臨床資料，探討精子DNA損傷對IVF/ICSI-ET結局的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析本中心初次行IVF/ICSI治療的192對不孕夫婦的臨床資料，其中IVF治療周期114個，ICSI治療周期78個。納入條件：①女方年齡≤35歲；②月經(jīng)規(guī)律，卵巢功能正常；③獲卵數(shù)≥5枚；④確診為盆腔因素或輸卵管因素不孕，排除子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 IVF/ICSI方案女方超排卵均采用常規(guī)長方案，月經(jīng)周期第21天開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α，達菲林) 0.1 mg/d，持續(xù)14 d。若卵泡刺激素(FSH)< 5 U/L，黃體生成素(LH)< 3 U/L，雌二醇(E2)< 183 pmol/L，雙側卵巢竇卵泡直徑≤5 mm，子宮內(nèi)膜<5 mm，即可啟動促性腺激素(Gn)，啟動Gn后持續(xù)皮下注射GnRH-0.05 mg/d，直至絨毛膜促性腺激素(hCG)注射日。啟動Gn后第5天開始B超檢測卵泡發(fā)育，當主導優(yōu)勢卵泡達18～20 mm，根據(jù)血清LH、P水平?jīng)Q定當晚是否肌注hCG 10000 U ，hCG肌注后36～37 h在陰道B超引導下取卵。

1.2.3 精液DNA完整性檢測手淫法取精后1 h內(nèi)取50 μl精液于EP管中，-80℃冰箱中冷凍保存。將冷凍的精液樣品迅速置于37℃水浴中復蘇。用冷TNE緩沖液(0.01 mol/L Tris HCl, 0.15 mol/L NaCl, 1 mol/L EDTA, pH 7.4)稀釋精子濃度為2×106/ml；取50 μl加入進樣管中，加入100 μl酸處理液(0.1% Triton X-100, 0.15mol/L NaCl, 0.08 mol/L HCl, pH 1.2)，振蕩混勻30 s，加300 μl AO染液染色2 min后，低速流動樣品，檢查精子流速，控制流速200～300個精子/s，每份精液樣本獲取10 000個精子的紅綠熒光。DNA完整性好，精子DNA碎片指數(shù)(DFI)≤15%；DNA完整性中等，15%27%。

1.2.4 分組根據(jù)DFI檢測值將192對患者夫婦分為DFI≤15%和DFI>15%兩個組。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較

符合納入條件的192對夫婦，其中IVF-ET 114個周期：DFI≤15% 70個周期(DFI≤15%組)，DFI>15% 44個周期(DFI>15%組)；ICSI-ET 78個周期：DFI≤15% 27個周期(DFI≤15%組)，DFI>15% 51個周期(DFI>15%組)。ICSI周期與IVF周期中DFI≤15%組與DFI>15%組對象一般情況均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

2.2 不同DFI組IVF-ET和ICSI-ET結局比較

IVF-ET周期中，DFI≤15%組和DFI>15%組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ICSI-ET周期中，DFI>15%組與DFI≤15%組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 精子DFI>15%患者不同受精方式的結局

精子DFI>15% 患者行IVF和ICSI治療的女方年齡、男方年齡、女方FSH水平均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，IVF組的精子濃度和精子活力明顯高于ICSI組(P<0.05)。IVF組與ICSI組受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表1　IVF-ET和ICSI-ET周期中不同DFI對象的一般情況比較

表2　不同DFI組IVF-ET和ICSI-ET結局比較

表3　DFI>15%患者不同受精方式治療情況比較

3 討論

精子發(fā)生是一個復雜而獨特的過程，涉及一系列有絲分裂和減數(shù)分裂過程，精子形成過程中組蛋白逐漸被過渡蛋白，最終被魚精蛋白代替。魚精蛋白能中和DNA電荷，降低DNA分子間靜電作用，精子DNA與魚精蛋白通過二硫鍵的交聯(lián)形成致密胞核，抵抗精子DNA在女性生殖道轉(zhuǎn)運過程中的破壞，保證遺傳物質(zhì)的完整性，并將父系遺傳信息完整地傳遞給卵母細胞，并在胚胎發(fā)育中正確地表達[3]。某些環(huán)境因素、病理性因素和醫(yī)源性損傷等通過精子染色質(zhì)組裝、氧化應激、精子凋亡等機制造成精子DNA損傷[4]。精子DNA損傷主要有DNA碎片增加，包括精子DNA雙鏈或單鏈的卵裂、異常染色質(zhì)包裝及魚精蛋白缺乏等形式[5]。

精子DNA損傷與男性不育有密切關系。男性不育癥患者的精子DNA損傷水平顯著高于生育力正常男性[6]，隨著精子DNA碎片的增加，精子頂體酶活性和精子穿透透明帶與卵黃膜融合的能力逐漸降低，影響受精率[7]。然而有些使用連續(xù)順序追蹤超聲檢查法檢測精子DNA完整性的研究顯示，精子DNA完整性與精子受精率無顯著相關性[8]。本研究嚴格篩選單純輸卵管性因素不孕，年齡≤35歲，卵巢功能正常，獲卵數(shù)≥5枚卵子的患者夫婦為研究對象。精子DNA完整性檢測是男方患者病因診斷的精液質(zhì)量檢測項目，本研究中男方患者精液均進行精子DNA損傷檢測。本研究結果證實，無論是IVF還是ICSI，精子DNA損傷均不影響卵子的受精率，而且當DFI>15%時，IVF和ICSI受精率仍無統(tǒng)計學差異?？赡苁且驗榕咛グl(fā)育最初僅受母源基因組調(diào)控，受精和胚胎早期發(fā)育都依賴于卵子本身的質(zhì)量[9]，而精子DNA是著床前胚胎發(fā)育的后期才開始表達，所以精子DNA對卵子受精的影響不大[10]。

本研究結果還顯示，在IVF和ICSI周期中，精子DFI與對優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無顯著影響。有研究顯示，無論是IVF組還是ICSI組，低DNA損傷組(DFI<30%)和高DNA損傷組(DFI≥50%)的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率均無統(tǒng)計學差異[11]，雖然在胚胎發(fā)育后期，父源基因組逐漸被激活，進而影響胚胎發(fā)育，但是胚胎自身可能也對精子DNA進行修復，干預精子DNA完整性對治療結局的影響。Zhang等[12]研究也認為精子DNA損傷對IVF或ICSI的流產(chǎn)率沒有影響，但是有研究則認為精子DNA損傷與囊胚獲得率呈負相關，且影響胚胎的繼續(xù)發(fā)育[13]。研究證實射線可使大鼠精子DNA有一定程度的氧化性損傷，卵子受精后，胚胎發(fā)育明顯受阻，甚至胚胎停止發(fā)育，死于子宮內(nèi)[14]。精子DNA碎片化會使精子在核染色體解凝聚過程中改變表觀遺傳，從而影響精子的功能，進而對著床后胚胎的發(fā)育和妊娠結局產(chǎn)生負面影響[15-16]。不同結論可能與研究過程中精子DNA完整性的檢測方法以及臨界值的確定、樣本的大小等差異有關。

本研究比較了精子DFI>15%患者不同受精方式的結局，結果發(fā)現(xiàn)IVF組與ICSI組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率和臨床妊娠率均無統(tǒng)計學差異，這與Frydman[10]的研究結果一致。對于精子DNA損傷多的患者，ICSI治療并不能改變其妊娠結局。

由于本研究中精子DFI>15%同時又滿足納入條件的不孕患者較少，故結論有一定的局限性，仍需更多的臨床研究進一步驗證。

參考文獻

[1]Henkel R, Kierspel E, Hajimohammad M, et al. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology [J]. Reprod Biomed Online, 2003, 7(4): 477-484.

[2]Seli E, Sakkas D. Spermatozoal nuclear determinants of reproductive outcome: implications for ART [J]. Hum Reprod Update, 2005, 11(4): 337-349.

[3]岳順利, 李樹峰, 嚴云勤. 乙醇對哺乳動物受精及胚胎發(fā)育的影響 [J]. 生殖與避孕, 2004, 24(1): 48-51.

[4]楊譯. 精子 DNA 損傷與男性不育的關系 [J]. 中國男科學雜志, 2011, 25(12): 67-69.

[5]Blumer CG, Fariello RM, Restelli AE, et al. Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele [J]. Fertil Steril, 2008, 90(5): 1716-1722.

[6]Giwercman A, Lindstedt L, Larsson M, et al. Sperm chromatin structure assay as an independent predictor of fertility in vivo: a case-control study [J]. International Journal of Andrology, 2010, 33(1): 221-227.

[7]Bakos HW, Thompson JG, Feil D, et al. Sperm DNA damage is associated with assisted reproductive technology pregnancy [J]. International Journal of Andrology, 2008, 31: 518-526.

[8]Tomsu M, Sharma V, Miller D. Embryo quality and IVF treatment outcomes may correlate with different sperm comet assay parameters [J]. Human Reproduciton, 2002, 17: 1856-1862.

[9]Meseguer M, Santiso R, Garrido N, et al. Effect of sperm DNA fragmentation on pregnancy outcome depends on oocyte quality [J]. Fertility and Sterility, 2011, 95(1): 124-128.

[10]Frydman N, Prisant N, Hesters L, et al. Adequate ovarian follicular status does not prevent the decrease in pregnancy rates associated with high sperm DNA fragmentation [J]. Fertility and Sterility, 2008, 89(1): 92-97.

[11]蔣歡歡, 賀小進, 宋兵，等.精子染色質(zhì)完整性對IVF/ICSI臨床結局的預測價值[J].中華男科學雜志, 2011,12: 1083-1087.

[12]Zhang Z, Zhu L, Jiang H, et al. Sperm DNA fragmentation index and pregnancy outcome after IVF or ICSI: a meta-analysis [J]. J Assist Reprod Genet, 2015, 32(1): 17-26.

[13]Lourdes M, Nicolas G, Jose F, et al. Value of he sperm deoxyribonucleic acid fragmentation level, as measured by the sperm chromatin dispersion test, in the outcome of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection [J]. Fertil Steril, 2006, 85(2): 371-383.

[14]Ahmadi A, Ng SC. Developmental capacity of damaged spermatozoa [J]. Hum Reprod, 1999, 14(9): 2279-2285.

[15]Lin MH, Kuo-Kuang LR, Li SH, et al. Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates [J]. Fertil Steril, 2008, 90: 352-359.

[16]Saxena P, Misro MM, Chaki SP, et al. Is abnormal sperm function an indicator among couples with recurrent pregnancy loss? [J]. Fertil Steril, 2008, 90: 1854-1858.

[責任編輯：張璐]

Study on sperm DNA fragmentation effecting on the outcomes of In Vitro Fertilization and Embryo Transfer

SHAO Shumin, LI Jiao, ZOU Min, HU Lian, ZHANG Ling*

FamilyPlanningResearchInstitute&CenterforReproductiveMedicineofTongJiMedicalCollege,HuangZhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

AbstractObjective: To assess sperm DNA fragmentation effecting on the outcomes of In Vitro Fertilization (IVF) and Embryo Transfer (ET). Methods: Retrospective analysis 192 couples who accepted IVF/ Intracytoplasmic sperm injection(ICSI)and ET. According to the DNA fragmentation index (DFI), the cases were divided into DFI≤15% group(low DFI group) and DFI>15% group(high DFI group). When patients were treated by IVF or ICSI, comparisons were made between high DFI group and low DFI group in the fertilization rate, embryo quality, rate of implantation, rate of clinical pregnancy and rate of abortion. In high DFI group, comparisons were also made between IVF and ICSI in the fertilization rate, embryo quality, and rate of clinical pregnancy rate. Results: During patients were treated by IVF or ICSI, no significant correlation of sperm DFI with fertilization rate, embryo quality, rate of clinical pregnancy and rate of implantation and rate of abortion (P>0.05). There was no significant difference when IVF compared to ICSI in the fertilization rate, embryo quality, and rate of clinical pregnancy rate (P>0.05). Conclusion: The sperm DNA fragmentation has no any effect on the outcomes of IVF/ ICSI and ET. As for patients with DFI≤15%, the outcome are similar when treated by IVF or ICSI .

Key wordsIn Vitro Fertilization; Embryo Transfer; Sperm DNA fragmentation; Rate of abortion

收稿日期：2015-07-09修回日期：2016-01-22

*通訊作者：zhling312@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.03

*Corresponding author:ZHANG Ling, Email: zhling312@163.com