陳凱，李紀(jì)順，張廣志，王貽蓮，趙曉燕，吳曉青，扈進(jìn)冬，楊合同

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東　濟(jì)南　250014）

中國新記錄種毛細(xì)木霉Trichodermacapillare及功能評(píng)價(jià)

陳凱，李紀(jì)順，張廣志，王貽蓮，趙曉燕，吳曉青，扈進(jìn)冬，楊合同*

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014）

摘要：木霉菌株TW22166分離自湖南省洞庭湖灘涂濕地，該菌株分生孢子梗具有長而發(fā)達(dá)的主軸，二次分枝豐富，不規(guī)則，一般單生，分生孢子梗向頂方向著生單個(gè)瓶梗。利用ITS、tef1及rpb2序列分析，發(fā)現(xiàn)該菌株同Trichodermacapillare同源性達(dá)到99%以上；在以rpb2構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，TW22166與TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］位于同一分支。該菌株在PDA平板上對(duì)9種植物病原真菌均有抑制作用，其中對(duì)Fusarium.oxysporum的抑制率為100.0%。菌株具有蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及纖維素酶活性，其中蛋白酶活性較高，透明圈寬度達(dá)16.0mm。該菌株鑒定為毛細(xì)木霉Trichodermacapillare，是木霉屬中國新記錄種，也是一株較有潛力的生物防治菌株。

關(guān)鍵詞：中國新記錄種；毛細(xì)木霉；抑菌能力；水解酶活性

木霉屬TrichodermaPers.屬于半知菌亞門Deuteromycotina、絲孢綱Hyphomycetes、絲孢目Hyphomycetales的粘孢菌類Gloiosporae?，F(xiàn)已證實(shí)其有性世代為子囊菌亞門Ascomycotina、肉座目Hypocreales、肉座科Hypocreaceae的肉座菌屬Hypocrea［1］。木霉是世界性分布真菌，主要存在于土壤、腐爛的木材及雜草中，因其在工業(yè)酶制劑、抗生素及生物防治等方面的應(yīng)用價(jià)值而受到廣泛關(guān)注［2－3］。開展木霉屬資源和系統(tǒng)分類研究，將豐富對(duì)我國該類群物種多樣性的認(rèn)識(shí)，不斷發(fā)掘和擴(kuò)大有應(yīng)用前景的物種資源，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和學(xué)術(shù)價(jià)值。截止目前，國際上已報(bào)道木霉種類236種［4－8］，其中國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的木霉種類為91種［9］，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類和鑒定對(duì)于木霉的研究應(yīng)用有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室于2015年4月沿洞庭湖周邊灘涂濕地采集土樣和水樣，從69個(gè)樣品中，已分離到木霉菌株171株，對(duì)分離到的木霉進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)序列分析，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)中國新記錄種，即毛細(xì)木霉T.capillare。

1　材料與方法

1.1培養(yǎng)基

PDAm：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，鏈霉素0.1g，氯霉素0.3g，玫瑰紅0.02g，曲酮0.5mL，蒸餾水1000mL。

PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

SNA：KH2PO41.0g，KNO31.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

CMD：玉米粉30g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：葡萄糖0.5g，MgSO4·7H2O0.3g，（NH4）2SO41g，K2HPO41.36g，膠體幾丁質(zhì)10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

纖維素培養(yǎng)基：葡萄糖0.5g，KH2PO415g，（NH4）2SO45g，CaCl20.6g，MgSO4·7H2O0.6g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.0016g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl2·6H2O0.0037g，CMCNa10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

蛋白酶培養(yǎng)基：葡萄糖0.5g，明膠10g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL。

1.2菌種分離

沿洞庭湖周邊灘涂濕地采集土樣和水樣，利用選擇性培養(yǎng)基PDAm分離木霉，經(jīng)單孢分離后保存。

1.3形態(tài)學(xué)觀察

分別在SNA、PDA和CMD上培養(yǎng)木霉菌株，定期觀察菌落形態(tài)及分生孢子梗、瓶梗的發(fā)育形態(tài)。

1.4分子鑒定

利用OMEGA公司的FungalDNAminiKit試劑盒提取木霉基因組DNA，分別用3對(duì)引物ITS1-F/ITS4、EF1-728F/EF200R、fRPB2-5f/fRPB2-7cR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物交上海生工生物股份有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果分別提交NCBI和ISTH網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5生物學(xué)功能評(píng)價(jià)

1.5.1供試植物病原真菌

立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、終極腐霉Pythiumultimum、灰葡萄孢Botrytiscinerea、大麗花輪枝孢Verticilliumdahliae、尖孢鐮孢Fusariumoxysporum、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、致病疫霉Phytophthorainfestans、紋枯絲核菌Rizoctoniacerealis和串珠鐮孢Fusariummoniliforme，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.5.2平板抑菌實(shí)驗(yàn)

平板直徑兩端距中心35mm處分別接種直徑5mm的木霉和病原真菌，以只接種病原真菌為對(duì)照，25℃培養(yǎng)，記錄病原真菌對(duì)峙方向生長半徑，計(jì)算抑制率（%）。

抑制率（%）＝（對(duì)照病菌生長半徑－處理病菌生長半徑）/對(duì)照病菌生長半徑×100%。

1.5.3平板水解酶活性檢測

主要檢測蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶活性。配制水解酶活性檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加0.05%的曲酮抑制菌落擴(kuò)散，25℃培養(yǎng)6d，記錄水解圈寬度。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株采集信息

菌株TW22166采集自湖南省洞庭湖，經(jīng)度113°0′27.19＂，緯度29°9′19.21＂，采集時(shí)間為2015年4月20日，植被類型為雜草，采集人：李紀(jì)順、王貽蓮。

2.2菌株形態(tài)學(xué)特征

菌株TW22166的形態(tài)學(xué)特征見圖1。于20、25、30、35、40℃培養(yǎng)3d，在SNA培養(yǎng)基上菌落半徑分別為38、64、75、71、15mm；在PDA培養(yǎng)基上菌落半徑分別為43、56、72、66、12mm，最適生長溫度和產(chǎn)孢溫度為30－35℃。于20℃培養(yǎng)7d，在SNA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生明顯的分生孢子，菌絲稀疏，成放射狀擴(kuò)散；在PDA培養(yǎng)基上形成一圈輪紋，氣生菌絲稀疏，并形成孢子簇，孢子簇為顆粒狀分布，灰綠色，培養(yǎng)基背面為淡黃色；在CMD培養(yǎng)基上形成一圈輪紋，白色到灰綠色孢子簇，氣生菌絲稀疏，卷毛狀，培養(yǎng)基背面為淡黃色。

分生孢子梗包括長而發(fā)達(dá)的主軸，二次分枝豐富，不規(guī)則，一般單生，少數(shù)二岐式分枝，缺乏不育菌絲。分生孢子梗向頂方向著生單個(gè)瓶梗，多數(shù)瓶梗直接產(chǎn)生于二次分枝上，成不對(duì)稱排列，一般不是漩渦狀排列。瓶梗燒瓶形或圓柱形，在中間稍微膨大，有時(shí)彎曲，瓶梗長（4.0－）6.5－10.5（－14.0）μm，最寬處（2.2－）3.0－3.5（－4.5）μm，基部寬（1.0－）2.2－2.6（－3.2）μm。

分生孢子橢圓形，黃綠色，大小為（4.4－）3.9－3.4（－2.4）×（2.8－）2.7－2.5（－2.3）μm。厚垣孢子亞球形，串生、間生或端生，產(chǎn)量較多，大小為（9.4－）7.8－6.4（－5.6）×（8.2－）6.7－5.5（－5.1）μm。

圖1　菌株TW22166的形態(tài)特征Fig.1morphological　characteristics　of　strain　TW22166

2.3菌株序列分析

菌株TW22166的ITS序列總長為673bp，在GenBank上的登錄號(hào)為KT862523，經(jīng)www.isth.info中的TrichOKEY進(jìn)行比對(duì)，分別在113、135、314、472、568處發(fā)現(xiàn)了木霉的5個(gè)DNA寡核苷酸條形編碼，表明TW22166為木霉屬，種類鑒定為Trichodermasp.MA3642。TW22166的tef1序列總長為664bp，在GenBank上的登錄號(hào)為KT862524，同TrichodermacapillarestrainGJS99-3［JN175584.1］同源性99%，TW22166的rpb2序列總長為1104bp，在GenBank上的登錄號(hào)為KT862525，同TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］同源性99%。

選取NCBI中與菌株TW22166的rpb2同源性不小于90%的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2，菌株TW22166與TrichodermacapillarestrainGJS06－66［JN175530.1］位于同一分支，而與其他菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2　以rpb2基因序列為分子標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2　Gene　sequences　rpb2　based　phylogenetic　tree

2.4菌株TW22166的平板抑菌作用

菌株TW22166在PDA平板上對(duì)供試9種植物病原真菌均具有較好的抑制作用，抑制率范圍為47.0%－100.0%，其中對(duì)B.cinerea的抑制率為47.0%，對(duì)F.oxysporum的抑制率為100.0%，對(duì)其他病原真菌的抑制率介于兩者之間（圖3）。

圖3　菌株TW22166的平板抑菌能力Fig.3　Antifungal　capability　of　strain　TW22166　on　PDA　plate

2.5菌株TW22166的水解酶活性

菌株TW22166在平板上具有蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性及纖維素酶活性，可產(chǎn)生明顯的透明圈，其中蛋白酶活性較高，透明圈寬度為16.0mm，結(jié)果見圖4。

A蛋白酶活性B幾丁質(zhì)酶活性C纖維素酶活性圖4　菌株TW22166的水解酶活性Fig.4　Hydrolase　activity　of　strain　TW22166

3　結(jié)論

傳統(tǒng)的木霉生物學(xué)鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，但木霉的形態(tài)性狀復(fù)雜多變且易受環(huán)境影響，缺少特有形態(tài)特征，給分類研究者對(duì)其進(jìn)行種的定義造成了極大的不便。近年來，人們將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于木霉屬的分類和系統(tǒng)進(jìn)化問題的研究中，開創(chuàng)了一個(gè)真菌系統(tǒng)分類學(xué)的新時(shí)代，并取得了顯著的成功［10］。

由于木霉的ITS和tef1序列同源性在種內(nèi)、種間差異存在重疊，可能導(dǎo)致部分種的錯(cuò)誤鑒定［11］，本文用rpb2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株TW22166與TrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］位于同一分支，而與其他菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，初步斷定菌株TW22166應(yīng)為Trichodermacapillare。其形態(tài)學(xué)特征也與其一致［12］，故將菌株TW22166鑒定為Trichodermacapillare。

菌株TW22166分生孢子梗形態(tài)屬于長枝組Longibrachiatum，該組木霉的共同特點(diǎn)為菌落生長快，最適生長溫度為30－35℃，在PDA上產(chǎn)生黃色色素，產(chǎn)孢簇為平展或松散的簇狀。分生孢子梗形成于氣生菌絲稀疏的培養(yǎng)物上，典型分生孢子梗包括強(qiáng)壯發(fā)達(dá)的中軸，初級(jí)分枝長，二級(jí)分枝通常短且少見再次分枝。瓶梗排列不規(guī)則，一般單生，燒瓶形或接近圓柱狀，常為鉤狀或彎曲。分生孢子為橢圓或長方形。厚垣孢子有或者無。

該組種類之間可以根據(jù)瓶梗的形態(tài)變化相互區(qū)別，也可以根據(jù)分生孢子的大小和形狀加以區(qū)分。T.capillare同其他長枝組木霉種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分枝更加不規(guī)則，孢子簇上產(chǎn)生細(xì)絲狀的氣生菌絲，顯著或不顯著，有隔膜，彎曲，不育，已知分布為美國、歐洲（奧地利、匈牙利）、越南、中國。

菌株TW22166在平板上產(chǎn)生厚垣孢子的能力較強(qiáng)，利用這一特點(diǎn)，可以重點(diǎn)研究該菌株發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子的條件，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量，制備以厚垣孢子為有效成分的木霉制劑，延長制劑的保存期及抗逆能力。而且菌株TW22166不但對(duì)植物病原真菌具有廣譜抗性，還具有多種水解酶活性，是一株較有潛力的生物防治菌株。

參考文獻(xiàn)：

［1］楊合同.木霉分類與鑒定［M］.北京：中國大地出版社，2009：1－6.

［2］KUBICEKCP，HARMANGE.TrichodermaandGliocladium（Volume1）Basicbiology，taxonomyandgenetics［M］.London，UK：TaylorandFrancisLtd，1998：3－8.

［3］GHISALBERTIEL.Anti-infectiveagentsproducedbythehyphomycetesgeneralTrichodermaandGlioclaudium［J］.CurrentmedicinalChemistry，2002，1（4）：343－374.

［4］張廣志，楊合同，張新建，等.木霉現(xiàn)有種類名錄［J］.菌物學(xué)報(bào)，2014，33（6）：1210－1230.

［5］JAKLITSCHWm，VOGLMAYRH.BiodiversityofTrichoderma（Hypocreaceae）inSouthernEuropeandmacaronesia［J］.Studieainmycology，2015，80：1－87.

［6］PARKmS，OHSY，CHOHJ，etal.Trichodermasongyisp.nov.，anewspeciesassociatedwiththepinemushroom（Tricholomamatsutake）［J］.AntonievanLeeuwenhoek，2014，106（4）：593－603.

［7］ZHUZX，ZHUANGWY.ThreenewspeciesofTrichodermawithhyalineascosporesfromChina［J］.Mycologia，2015，107（2）：328－345.

［8］ZHUZX，ZHUANGWY.Trichoderma（Hypocrea）specieswithgreenascosporesfromChina［J］.Persoonia，2015，34：113－129.

［9］朱兆香，莊文穎.木霉屬研究概況［J］.菌物學(xué)報(bào)，2014，33（6）：1136－1153.

［10］羅俊彩，扈進(jìn)冬，李紀(jì)順，等.分子生物學(xué)方法在木霉菌分類研究中的應(yīng)用［J］.山東科學(xué)，2010，23（4）：17－21.

［11］ZHUZX，ZENGZQ，ZHUANGWY.SelectionofasupplementaryDNAbarcodeforthegenusTrichoderma（Hypocreales，Ascomycota）［J］.菌物學(xué)報(bào)，2014，33（6）：1253－1262.

［12］SAMUELSGJ，ISMAIELA，MULAWTB，etal.TheLongibrachiatumCladeofTrichoderma：Arevisionwithnewspecies［J］.FungalDivers.2012，55（1）：77－108.

ChinesenewrecordTrichodermacapillareanditsfunctionalassessment

CHENKai，LIJi-shun，ZHANGGuang-zhi，WANGYi-lian，ZHAOXiao-yan，WUXiao-qing，HUJin-dong，YANGHe-tong*

（ShandongProvincialKeyLaboratoryofAppliedmicrobiology，BiologyInstitute，BiotechnologyCenter，ShandongAcademyofSciences，Jinan250014，China）

Abstract：TrichodermastrainTW22166wasisolatedfromsoilsamplesofDongtingLakemudflatwetlandofHunanprovince，China.Itsconidiophoreshadastronglydevelopedcentralaxisfromwhichphialidesarisesinglyoverseverallevelsbelowthetipasinglephialideterminatingabasalcellwithashort，spur-likephialidearisingasanoutgrowthofthebasalcellattheseptum.Throughdetectingmolecularmarkers（ITS，tef1andrpb2），wediscoveredthatitshomologywithTrichodermacapillarewasmorethan99%byNCBI.Inrpb2sequencesbasedphylogenetictree，strainTW22166andTrichodermacapillarestrainGJS06-66［JN175530.1］wereononeidenticalbranch.StrainTW22166exhibitedantifungalcapabilityagainst9plantpathogenicfungionPDAplate，anditsinhibitionratioagainstFusariumoxysporumwasupto100.0%.Ithadproteinase，chitinaseandcellulaseactivity，amongwhichproteinaseactivitywashigheranditshydrolyzationradiuswas16.0mm.StrainTW22166wasidentifiedasTrichodermacapillare，aChinesenewrecordofgenusTrichodermawhichwasapotentialbiologicalpreventionandcontrolstrain.

Keywords：Chinesenewrecord；Trichodermacapillare；antifungalcapability；hydrolaseactivity

中圖分類號(hào)：Q939.5；S476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026（2016）01-0093-05

DOI：10.3976/j.issn.1002－4026.2016.01.016

收稿日期：2015-11-06

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2015GNC113003）；山東省攻關(guān)計(jì)劃（2014GSF121028）；科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2014FY120900）

作者簡介：陳凱（1968－），女，工程師，研究方向?yàn)槲⑸?。Email：chenkai19960917＠163.com

*通訊作者，楊合同（1966－），男，博士，研究員，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。Email：yanght＠sdas.org