王雪，甄璟然，孫正怡，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必，何方方

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產科生殖中心，北京　100730)

·臨床研究·

囊胚冷凍保存時間對復蘇移植臨床結局的影響

王雪，甄璟然，孫正怡*，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必，何方方

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產科生殖中心，北京100730)

【摘要】目的分析冷凍保存時間對復蘇后胚胎質量的影響，進一步探討長期胚胎冷凍保存是否對臨床結局產生影響。方法回顧性分析2005年12月至2015年1月在我院輔助生殖中心進行復蘇囊胚移植患者的臨床資料。按照復蘇前囊胚的冷凍保存時間將1 808個移植周期分為7組，第1組為≤90 d、第2組為91～180 d、第3組為181～360 d、第4組為361～720 d、第5組為721～1 080 d、第6組為1 081～1 440 d、第7組為≥1 441 d。比較7組的復蘇后存活率、種植率、臨床妊娠率、流產率和活產率以及各組間單胎的新生兒出生結局。結果7組間胚胎存活率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率和活產率比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)；7組間的單胎新生兒出生結局比較亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結論本研究提示胚胎長期冷凍保存對凍融胚胎的質量及發(fā)育潛力影響不大，但囊胚長期冷凍保存的遠期安全性還有待于進一步研究。

【關鍵詞】凍融胚胎移植；冷凍保存時間；種植率；臨床妊娠率；活產率

Objective： To analyze the effect of cryopreservation storage time on embryo quality after frozen-thawed and clinical pregnancy outcome.

Methods： The data of 1 808 transfer cycles with frozen-thawed blastocysts in our productive center from December 2005 to January 2015 were retrospectively analyzed. The patients were divided into 7 groups according to the cryopreservation storage time：group 1(≤90 days)；group 2 (91-180 days)；group 3 (181-360 days)；group 4 (361-720 days)；group 5 (721-1 080 days)；group 6 (1 081-1 440 days)；group 7(≥1 441 days). And then the survival rate，implantation rate，pregnancy rate and live birth rate were compared among the seven groups.

Results： The storage time did not significantly affect embryo survival rate. There were no significant differences in implantation rate，pregnancy rate，abortion rate and live birth rate among the seven groups (all P>0.05). The outcomes of single fetus newborn were also not significantly different(P>0.05).

Conclusions： The study results indicate that the cryopreservation storage time do not affect embryo quality and embryo developmental potential. More studies are needed to evaluate the safety of long-term cryopreservation.

Key words： Frozen-thawed embryo transfer；Cryopreservation storage time；Implantation rate；Pregnancy rate；Live birth rate

(J Reprod Med 2016，25(5)：389-394)

自1983年第一例人類冷凍胚胎成功臨床妊娠后，人類胚胎冷凍保存技術迅速發(fā)展并廣泛地被世界各地的輔助生殖中心接受，成為輔助生殖技術的重要組成部分。胚胎凍融移植能夠降低卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生率，并可通過控制移植胚胎數而減少多胎發(fā)生，由此可提高治療的安全性；同時還能提供多次胚胎移植機會，從而提高一次取卵周期的累積妊娠率，降低患者治療費用。近年來隨著卵巢超排卵方案和實驗室技術的改善，以及對生育力保護的強調，冷凍胚胎的數量不斷增加。大量胚胎被冷凍保存數年，就引起了人們對于儲存時間對胚胎活力和隨后種植能力的影響的關注。有研究發(fā)現(xiàn)胚胎冷凍保存時間不會影響胚胎質量[1-3]，但是也有研究發(fā)現(xiàn)人類胚胎冷凍保存幾個月后，胚胎的細胞死亡增加[4-5]。目前關于囊胚玻璃化冷凍的保存時間與臨床結局相關的數據較少，因此本研究將分析不同冷凍保存時間對復蘇后胚胎質量的影響，進一步探討長期胚胎冷凍保存是否對臨床結局產生影響。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2005年12月至2015年1月在北京協(xié)和醫(yī)院輔助生殖中心進行復蘇囊胚移植患者的臨床資料。所有囊胚均采用玻璃化方法進行冷凍和復蘇。

納入標準：新鮮周期的不育原因為輸卵管因素、子宮內膜異位癥及子宮腺肌癥、男方因素、排卵障礙(包括多囊卵巢綜合征等)、不明原因不育。

共收集1 811個復蘇周期，其中3例因為移植日胚胎質量差放棄移植，因此可納入分析的周期數為1 808個。按照復蘇前囊胚的冷凍保存時間分為7組，第1組為≤90 d、第2組為91～180 d、第3組為181～360 d、第4組為361～720 d、第5組為721～1 080 d、第6組為1 081～1 440 d、第7組為≥1 441 d。

二、研究方法

1. 囊胚培養(yǎng)及質量評價：取卵周期采用本中心常規(guī)方案進行超促排卵，獲卵后根據患者情況采用體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)授精，取卵24 h后觀察受精情況，72 h觀察卵裂球胚胎情況，根據胚胎評分情況決定移植；移植后剩余胚胎經患者知情同意后全部行囊胚培養(yǎng)，在受精后第5日或第6日分別觀察囊胚形成情況及形態(tài)，采用Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進行評分。首先根據囊腔擴張程度分為1～6期，然后對4～6期的囊胚進一步根據內細胞團(ICM)和滋養(yǎng)外胚層細胞(TE)表現(xiàn)評為A～C級。

2. 囊胚冷凍：鑒于先前發(fā)現(xiàn)早期囊胚及孵出的囊胚冷凍后復蘇率不甚理想[6]，故而本中心均在囊胚發(fā)育至4期時選取內細胞團質量A或B級的囊胚凍存，C級者放棄，而滋養(yǎng)層細胞質量不限。

本中心全部采用玻璃化冷凍方法進行胚胎冷凍。具體方法如以往文章所述[7-8]。囊胚冷凍之前進行人工皺縮，然后將囊胚放入含有7.5%(v/v)DMSO和7.5%(v/v)乙二醇的預平衡液中平衡2 min，之后將胚胎轉移入玻璃化冷凍液[15%(v/v)DMSO+15%(v/v)乙二醇+0.65 mol/L蔗糖+10 mg/ml Ficoll]中平衡30 s，將胚胎轉移至冷凍環(huán)(cryoloop環(huán))上，直接浸入液氮保存。

3. 胚胎復蘇：于移植當天進行。囊胚復蘇之前，在胚胎培養(yǎng)皿內分別配制復蘇液：0.33 mol/L蔗糖溶液、0.2 mol/L蔗糖溶液和基礎培養(yǎng)液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)；將載有囊胚的冷凍環(huán)從液氮中取出，空氣中停留5 s后直接將胚胎依次浸入上述復蘇液中，時間分別為2 min、3 min和5 min；復蘇后囊胚在遠離細胞團的透明帶上部位激光切割透明帶1/4左右行輔助孵化；將囊胚移入預先配制的囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中，于37℃、6% CO2和5% O2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h。囊胚腔重新擴張者判斷為囊胚存活。

4. 子宮內膜準備及胚胎移植：內膜準備方法分為兩種：(1)自然周期法：用于月經周期規(guī)律、排卵正常的患者，在排卵前注射HCG 2 000 U(艾澤，默克-雪蘭諾，德國)，于超聲監(jiān)測到卵泡破裂后開始黃體支持，肌注黃體酮(浙江仙琚)20～40 mg/d，在排卵后第6日移植胚胎。(2)人工周期法：月經第2～4日常規(guī)B超檢查，口服戊酸雌二醇(補佳樂，先靈，德國)，根據患者既往內膜情況，選擇不同起始劑量(2～18 mg/d)。當內膜厚度≥8 mm時肌注黃體酮(20 mg×2 d、40 mg×2 d、20～40 mg×1 d)，肌注黃體酮后第6日在B超引導下行囊胚復蘇移植，每周期移植1～2枚胚胎。移植后常規(guī)肌注黃體酮行黃體支持。

5. 妊娠結局判斷：移植后第7日測血清HCG>5 U/L判定為生化妊娠，移植后4周超聲檢查見胎心和胎囊則為臨床妊娠。種植率：B超下妊娠囊總數占移植囊胚總數的百分比；早期妊娠丟失率：移植后第7日判定為生化妊娠而之后超聲未見胎囊者的例數與復蘇移植周期總例數的百分比；臨床妊娠率：臨床妊娠總例數與復蘇移植周期總例數的百分比；流產率：妊娠過程中流產的例數占臨床妊娠總例數的百分比；活產率：隨訪獲得活產的總例數與復蘇移植周期總例數的百分比。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所測數據采用均數±標準差表示，均數比較采用t檢驗，率的比較進行卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、總體情況

本研究共收集1 811個復蘇周期，其中3例因為移植日胚胎質量差放棄移植，因此可納入分析的周期數為1 808個。復蘇胚胎3 368個，存活3 238個，存活率為96.1%。平均移植胚胎數為(1.79±0.42)個。超聲下見到妊娠囊1 483個，種植率為45.7%(1 483/3 242)；1 096例患者獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為60.6%(1 096/1 808)；妊娠后流產115例，流產率為10.7%(117/1 096)；宮外孕發(fā)生率為1.3%(14/1 096)；活產率為53.4%(965/1 808)。

二、不同冷凍保存時間的胚胎復蘇情況

囊胚冷凍時的各組患者平均年齡和內膜厚度比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，復蘇移植時的患者年齡和不育年限比較有統(tǒng)計學差異，隨著胚胎冷凍保存時間的增加，復蘇時年齡增加(P<0.05)。盡管各組間移植胚胎數比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但是第7組的移植胚胎數略低(表1)。

三、不同冷凍保存時間的胚胎復蘇后臨床結局

7組的胚胎存活率、胚胎種植率、早期妊娠丟失率、臨床妊娠率、流產率和活產率之間均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，但第5組的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產率略低于其他組(表2)。

四、不同冷凍保存時間的胚胎復蘇后的出生結局

多胎妊娠的影響因素較多，為了避免降低分析的有效性，在本研究中我們只分析復蘇單囊胚移植的出生結局。我們發(fā)現(xiàn)7組間的孕天數、嬰兒出生體重及體長比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，低出生體重比例、男女性別比和畸形率亦無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)(表3)。

表1　各組患者一般情況比較 (x-±s)

注：組間比較，*P<0.05

表2　不同冷凍保存時間的胚胎復蘇后的臨床結局(%)

表3　單胎新生兒出生結局 (x-±s)

討論

胚胎冷凍技術是指將胚胎置于超低溫的環(huán)境(液氮，-196℃)中冷凍保存，待需要時再將冷凍的胚胎解凍恢復至正常生理溫度的技術。胚胎冷凍技術的出現(xiàn)，不僅可以使一次促排卵周期中形成的過剩胚胎得到保存，也避免了移植胚胎數量過多而引起的多胎，提高了治療的安全性，使患者從一次促排卵治療周期中獲得多次胚胎移植機會，大大提高了臨床累計妊娠率。因此，胚胎冷凍保存技術在輔助生殖操作中得到廣泛應用。但是人們不禁擔心液氮中胚胎長期存放的安全性，以及隨著凍存時間的延長，解凍后胚胎的復蘇率和妊娠率等臨床結局會否受到影響。目前這些尚無定論。而且在之前的研究中，多是以慢速冷凍卵裂期胚胎為主，關于囊胚期胚胎玻璃化冷凍的研究較少。因此本研究著重分析囊胚玻璃化冷凍的保存時間對胚胎存活和臨床結局的影響。

關于胚胎在液氮中的保存時間尚無明確結論。早期有研究發(fā)現(xiàn)隨著冷凍保存時間的延長，人胚胎的復蘇后存活率下降[4]，小鼠胚胎復蘇后的活力下降且染色體異常的發(fā)生率增加[9]。但后期大多數學者認為胚胎的冷凍保存時間不會影響凍融胚胎的質量和存活。因為在超低溫中細胞的酶活力幾乎完全受抑，細胞進程處于“停滯”狀態(tài)，Mazur[10]認為細胞在液氮中保存千年依然可以存活并保持其發(fā)育潛能。Cohen等[11]發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍保存時間對卵裂球存活率沒有顯著影響，Lavara等[12]發(fā)現(xiàn)冷凍保存時間對兔胚胎的存活率沒有影響，最近Riggs等[13]對人胚胎進行的一個大樣本的研究也表明冷凍時間的長短并不影響胚胎復蘇后的存活率。但是這些研究多是分析卵裂期胚胎冷凍的結局。最近Wirleitner等[14]分析了囊胚玻璃化冷凍后不同凍存時間的復蘇后存活情況，也發(fā)現(xiàn)囊胚的冷凍保存時間對囊胚復蘇后的存活率沒有顯著影響。我們的研究結論與之相似，在本研究中我們全部采用玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)冷凍保存時間對胚胎復蘇后存活率沒有顯著影響。

為了進一步觀察復蘇后胚胎的發(fā)育潛能，我們分析了相關臨床結局和冷凍時間的相關性。發(fā)現(xiàn)囊胚的冷凍保存時間對胚胎的種植率、臨床妊娠率、流產率和活產率沒有顯著影響。同時我們還觀察了新生兒出生結局，以分析囊胚長期冷凍保存的安全性。我們發(fā)現(xiàn)各組間新生兒的出生結局無統(tǒng)計學差異。因此，本研究認為囊胚長期冷凍保存是安全的，這與之前的研究結論相似。Riggs等[13]分析了原核期胚胎和卵裂期胚胎冷凍保存數年復蘇后胚胎的活力與冷凍保存時間的關系，他們發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍保存時間不會影響復蘇后胚胎的活力，也不會影響臨床結局。Liu等[3]分析了卵裂期胚胎慢速冷凍復蘇后，胚胎的保存時間與臨床結局的關系，他們發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍保存時間不會影響卵裂期胚胎復蘇后的存活率，也不會影響胚胎的種植率和臨床妊娠率。目前胚胎的冷凍時機包括原核期、卵裂期和囊胚期，在前面的研究多是分析卵裂期胚胎長期冷凍保存后的結局，最近也有研究開始分析囊胚階段冷凍保存時間與臨床結局的關系。Yao等[15]分析了羊的桑葚胚或囊胚冷凍保存0.5年或7.5年后的臨床結局，他們發(fā)現(xiàn)兩組胚胎復蘇后活力無顯著性差異，追蹤出生結局發(fā)現(xiàn)兩組的出生率、性別比和出生體重均無明顯差異，他們認為桑葚期或囊胚期胚胎可以在液氮中長期保存。Wirleitner等[14]發(fā)現(xiàn)人類囊胚玻璃化冷凍后的保存時間不會影響囊胚的活力和發(fā)育潛能，各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率和活產率以及出生后的新生兒特征均無顯著性差異。在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)第3～5組(凍存時間181～1 080 d)的臨床妊娠率和活產率略低于保存時間短和保存時間更長組，分析原因可能與保存時間關系不大，可能是由于不同組別的患者特征造成的。如果患者在新鮮周期妊娠，意味著患者胚胎質量好，更容易形成囊胚，種植潛能高，而且距離下次復蘇移植的時間會更久一些；而新鮮周期沒有妊娠或發(fā)生早期流產的，意味著患者胚胎質量差，種植潛能差，多會在短期內再進行復蘇移植。具體原因還有待于進一步研究。

雖然理論上胚胎在液氮中可以長期保存，但是我們知道液氮罐的安全使用和宇宙背景的輻射也可能會影響胚胎的長期保存。如果液氮罐保存不恰當，液氮補充不及時，都會影響胚胎的冷凍效果。為了保證胚胎冷凍時的降溫速率更高，我們多采用開放性載體進行冷凍保存，而微生物也可以在低溫下長期存活，因此在保存過程中存在污染風險[16]。關于宇宙輻射的影響，Glenister等[17]曾用相當于自然界2 000年的宇宙背景累積輻射作用于小鼠胚胎，但小鼠胚胎的生存能力并未受到可檢測到的影響。

Dowling-Lacey等[18]曾報道原核期胚胎冷凍保存近20年后解凍移植，成功獲得妊娠并分娩健康男嬰。Reed等[19]也曾利用凍存13.5年的胚胎解凍移植，分娩一健康嬰兒。本研究中凍融胚胎移植獲得妊娠并分娩的病例中，最長冷凍保存時間為8.6年(3 085 d)?？傊?，本研究提示胚胎冷凍保存時間與凍融胚胎質量和其發(fā)育潛力無明顯相關性，胚胎長期冷凍保存對新生兒結局無顯著影響。但是目前關于胚胎冷凍復蘇后妊娠獲得的新生兒的隨訪數據較少，因此囊胚長期冷凍保存的遠期安全性還有待于進一步研究。

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[編輯：羅宏志]

Effect of long-term cryopreservation of human blastocysts on clinical pregnancy outcome

WANG Xue，ZHEN Jing-ran，SUN Zheng-yi*，YU Qi，DENG Cheng-yan，ZHOU Yuan-zheng，WANG Han-bi，HE Fang-fang

Department of Obstetrics & Gynecology，Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100730

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.05.001

【收稿日期】2016-01-04；【修回日期】2016-02-18

【作者簡介】王雪，女，山東濰坊人，博士，實習研究員，生殖內分泌專業(yè).(*通訊作者，Email：sunzhengyi@263.com)