劉美慧,李建科,劉柳

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710019)

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金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

劉美慧,李建科,劉柳*

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710019)

摘要金黃色葡萄球菌在食品加工設(shè)備表面和儲(chǔ)藏過程中極易形成生物膜，形成的生物膜很難被徹底清除，并且可以保護(hù)膜內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌，從而給食品安全乃至整個(gè)食品產(chǎn)業(yè)帶來了安全隱患。該文綜述了生物膜形成過程中相關(guān)基因和目前常用生物膜定量定性檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展，為深入了解生物膜形成機(jī)理以及定量定性檢測(cè)相關(guān)方法提供一定的參考。

關(guān)鍵詞金黃色葡萄球菌;生物膜;基因;檢測(cè)方法

生物膜是微生物為其自身創(chuàng)造的獨(dú)特環(huán)境，是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境而采取的一種生存策略，當(dāng)細(xì)菌處于極端的生長(zhǎng)條件時(shí)，會(huì)附著在濕潤(rùn)的固體生物材料表面并形成一種與浮游細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式，自然環(huán)境中90%的細(xì)菌是以生物膜的形式存在的。生物膜中除了菌體和水外，還有多糖、蛋白質(zhì)、核酸和多價(jià)陽(yáng)離子等物質(zhì)[1]，主要來自菌體分泌物、營(yíng)養(yǎng)物、代謝產(chǎn)物和菌體裂解物等[2]，細(xì)菌群體可以嵌入到由胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA組成的生物膜基質(zhì)中來保護(hù)自身[3]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種常見的食源性病原菌，在食品儲(chǔ)存和加工過程中，其極易在富有養(yǎng)分的塑料和不銹鋼等生物材料表面附著并形成生物膜，在加工設(shè)備表面形成的生物膜因其中可能含有相當(dāng)數(shù)量的腐敗菌和致病菌，所以被認(rèn)為對(duì)健康有很大的危害[4]。生物膜在常用的清潔操作中很難徹底去除，所以使得加工設(shè)備表面損害、熱傳遞效率減弱、能耗增加，致使企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，更重要的是，形成的生物膜可以很好的保護(hù)膜內(nèi)的菌體不被清除，從而給食品安全埋下了巨大的隱患[5]。但是，生物膜的形成也并不都是有害的，例如它可能有助于發(fā)酵食品的生產(chǎn)和廢物處理[6]。近年來，有關(guān)生物膜的組成、形成過程及其耐藥性機(jī)制的研究工作迅速展開，將對(duì)細(xì)菌生物膜的關(guān)注程度提高到了前所未有的高度并仍保持上升的趨勢(shì)，本文將從金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因及目前常用的生物膜檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1生物膜形成相關(guān)基因

已有的研究表明，與浮游生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)菌相比，金黃色葡萄球菌在生物膜生長(zhǎng)狀態(tài)下有48個(gè)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，84個(gè)基因的表達(dá)受到抑制[7]。生物膜基質(zhì)除了含有胞間多糖黏附素(PIA)外，還包括多種成分，如凝聚因子A(ClfA)和B(ClfB)、金黃色葡萄球菌表面蛋白G(SasG)、生物膜相關(guān)蛋白(Bap)、纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBPs)等其他蛋白和核酸。

1.1胞間多糖粘附素(PIA)

金黃色葡萄球菌生物膜形成受多種因子影響，但因生物膜基質(zhì)的主要成分是胞間多糖黏附素，所以其對(duì)生物膜形成的影響最大，也是目前研究最深入的。胞間多糖黏附素(PIA)，是由部分脫去乙?；鶜埢摩?1-6N-乙酰葡糖胺組成的多聚糖，所以有時(shí)也被稱為PNAG，由依賴于ica操縱子編碼的葡糖胺轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)合成，在生物膜形成的聚集階段起胞間黏附作用，對(duì)生物膜的完整性有重要作用[8]。但是很多研究證明獨(dú)立于ica操縱子的生物膜形成能力的金葡菌株也存在[9]。ica操縱子由icaR管理基因和icaABCD合成基因組成，研究發(fā)現(xiàn)，缺失icaR基因后菌株的PIA生成量會(huì)增加，說明icaR表現(xiàn)為一種阻遏基因。Christiane等[10]發(fā)現(xiàn)，icaA、icaC和icaD蛋白都位于細(xì)胞膜上，而icaB蛋白則主要出現(xiàn)在培養(yǎng)液中，單獨(dú)的icaA蛋白只有很低的葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性，而當(dāng)icaA蛋白與icaD蛋白共同表達(dá)時(shí)，葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的活性會(huì)提高大約20倍，icaB是一種分子質(zhì)量為33 kDa的分泌到培養(yǎng)液中的與根瘤菌NodB蛋白有相似序列的蛋白質(zhì)，icaC蛋白分子質(zhì)量為42 kDa，但其功能目前還不能確定，據(jù)推測(cè)，它很可能參與多糖通過細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移。且目前分離出的金黃色葡萄球菌菌株中幾乎都含有ica操縱子。

1.2凝聚因子

葡萄菌屬可以在其細(xì)胞表面表達(dá)一些纖維蛋白原結(jié)合蛋白，凝聚因子就是其中一種，凝聚因子A(ClfA)是金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)細(xì)胞表面主要的纖維蛋白原結(jié)合蛋白，是目前已經(jīng)研究較深入的一種細(xì)菌表面識(shí)別黏附基質(zhì)蛋白[11]。ClfB是繼ClfA之后被發(fā)現(xiàn)的一種新的凝聚因子，EIDHIN等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ClfA和ClfB都是介導(dǎo)金黃色葡萄球菌粘附到纖維蛋白原的表面粘附素，是clfA和clfB基因的表達(dá)產(chǎn)物，它們有很相似的分子序列。但因ClfB識(shí)別的是纖維蛋白原配體尾部的α鏈和β鏈，而ClfA結(jié)合的是纖維蛋白原配體尾部的γ鏈，所以ClfB和ClfA與纖維蛋白原結(jié)合的機(jī)制可能不同，此外，與ClfA不同的是，ClfB可以提高對(duì)數(shù)期菌體結(jié)合纖維蛋白原的活性，而對(duì)穩(wěn)定期細(xì)菌與纖維蛋白原結(jié)合能力沒有作用。NABIL等[13]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌在缺少鈣離子和金屬蛋白酶被破壞的條件下，就會(huì)啟動(dòng)由ClfB介導(dǎo)的生物膜形成過程，且在缺少鈣離子的環(huán)境條件下，ClfB是金黃色葡萄球菌生物膜形成的必要物質(zhì)。

1.3金黃色葡萄球菌表面蛋白(SasG)

SasG蛋白是由sasG基因編碼合成的一種與表皮葡萄球菌聚集相關(guān)蛋白Aap具有相似序列的金黃色葡萄球菌的新型表面蛋白。CORRIGAN等[14]研究表明：SasG蛋白的N端包含一段含有157個(gè)殘基但Aap蛋白中不存在的獨(dú)特序列，還含有一段與Aap蛋白同源性為59%的保守序列。GEOGHEGAN等[15]的研究表明，SasG蛋白主要在生物膜形成的積累階段發(fā)揮作用，金黃色葡萄球菌表達(dá)的SasG會(huì)掩蓋指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞表達(dá)的SPA、凝聚因子B(ClfB)、纖維粘連蛋白結(jié)合蛋白FnBPs與IgG、細(xì)胞角蛋白及纖維粘連蛋白結(jié)合的能力，同時(shí)，也會(huì)掩蓋由ClfB、FnBPs所介導(dǎo)的與纖維蛋白原的結(jié)合，另外，可表達(dá)SasG蛋白的菌株會(huì)在細(xì)胞壁上形成不同濃度的菌毛，可能由于菌株產(chǎn)生的纖毛掩蓋了細(xì)菌表面識(shí)別黏附基質(zhì)分子與配體的結(jié)合，從而促進(jìn)了生物膜的產(chǎn)生。

1.4生物膜相關(guān)蛋白(Bap)

生物膜相關(guān)蛋白也是生物膜中常見的組分，它們一般在菌體與生物材料的初始黏附階段發(fā)揮胞間黏附作用。而且從金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的第一種生物膜相關(guān)蛋白就是Bap蛋白，它是一種含有2 276個(gè)氨基酸的表面蛋白，由bap基因編碼合成[16]，其主要促進(jìn)菌體在生物膜形成的初始附著階段與親水性材料的附著和細(xì)胞間粘附。CUCARELLA等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺失bap基因的菌株產(chǎn)PIA/PNAG的能力減弱，而缺失icaADBC操縱子的菌株仍能生成生物膜，可見生物膜的形成并不完全依賴于PIA和icaADBC操縱子，也說明Bap蛋白能夠替代生物膜常規(guī)的PIA合成機(jī)制并介導(dǎo)生物膜的形成，但是bap基因在金黃色葡萄球菌中出現(xiàn)的概率很低，目前僅在從奶牛乳腺炎中分離出的金黃色葡萄菌株中發(fā)現(xiàn)過，在人類感染中還沒有發(fā)現(xiàn)[18]。

1.5纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBPs)

FnBPs是一類可以促進(jìn)細(xì)菌與纖維蛋白原、彈性蛋白和纖連蛋白結(jié)合的多功能蛋白，其中FnBPA和FnBPB分別是fnbA和fnbB基因的表達(dá)產(chǎn)物，HOUSTON等[19]發(fā)現(xiàn)缺失fnbA和fnbB基因的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)會(huì)失去與纖連蛋白結(jié)合和形成生物膜的能力，說明FnBPs可以介導(dǎo)金黃色葡萄球菌生物膜的形成，且主要參與菌體與生物材料最初的附著過程和生物膜形成的聚集階段[20]。McCourt等[21]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)nBPs通過DLL機(jī)制與纖維蛋白原結(jié)合，其促生物膜形成區(qū)域位于N端結(jié)構(gòu)域的N2和N3子域，纖連蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于其C端的結(jié)構(gòu)域，通過原子力顯微鏡技術(shù)證明FnBPs通過多種低親和力鍵來介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的胞間黏附，且表皮葡萄球菌SdrG蛋白的N2和N3子域也被證明可以促進(jìn)相鄰細(xì)胞間的粘附作用，所以推測(cè)同種屬間的這種相鄰細(xì)胞間的胞間黏附作用也可能是一種促進(jìn)生物膜形成的普遍存在的機(jī)制。

2生物膜檢測(cè)方法

隨著人們對(duì)細(xì)菌生物膜的研究和認(rèn)識(shí)越來越深入，生物膜的檢測(cè)方法也逐漸增多。因細(xì)菌生物膜主要由細(xì)菌及其分泌的胞外基質(zhì)組成，而多糖又是胞外基質(zhì)的主要成分[22]，所以細(xì)菌生物膜的檢測(cè)方法主要也是針對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)觀察。主要方法有以下幾種：

2.1染色法

當(dāng)生物膜膜內(nèi)物質(zhì)和某些染料結(jié)合之后，我們就可以通過染色的方法對(duì)生物膜進(jìn)行檢測(cè)，最常用的是結(jié)晶紫染色法[23]。生物膜造膜結(jié)束后，經(jīng)固定、染色和溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度值的來反映生物膜的量，該法所用儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適用于試管及細(xì)胞培養(yǎng)板造膜，目前已經(jīng)成為一種廉價(jià)、簡(jiǎn)便和常用的生物膜半定量檢測(cè)方法。

剛果紅瓊脂法是對(duì)細(xì)菌生物膜的胞外多糖粘附素進(jìn)行染色的方法，生物膜形成過程中產(chǎn)生的胞間多糖黏附素可以與剛果紅牢固結(jié)合，如果菌落呈現(xiàn)紅褐色、干燥并且出現(xiàn)結(jié)晶，則證明生物膜已形成。該法是一種操作簡(jiǎn)便且快速的體外細(xì)菌生物膜形成的定性檢測(cè)方法，但是JOHANNES等[24]試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)剛果紅瓊脂法與平板培養(yǎng)法和試管法沒有很好的相關(guān)性，所以并不建議其作為一種較準(zhǔn)確的生物膜檢測(cè)方法，但此方法可以用于一些產(chǎn)生物膜較強(qiáng)菌株突變體的篩選。

銀染法是利用銀離子被還原為金屬銀沉淀在蛋白質(zhì)表面而顯色的方法。受試菌在生物材料表面黏附形成一定大小的菌落并逐漸擴(kuò)大，此時(shí)應(yīng)用銀染法即可分辨產(chǎn)生物膜的菌株。梁俐等[25]分別用掃描電鏡和銀染法染色后應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡來觀察細(xì)菌生物膜在藥物作用前后的變化情況，發(fā)現(xiàn)使用銀染法后用普通光鏡觀察大腸桿菌生物被膜變化的情況與用掃描電鏡觀察的結(jié)果一致，銀染后利用普通光學(xué)顯微鏡可以更為便捷地觀察大腸桿菌生物膜的變化情況且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。銀染法操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求較低，在普通實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行，操作省時(shí)、簡(jiǎn)便，臨床上可用于大量細(xì)菌生物膜形成能力的鑒定[26]。

2.2鏡像法

利用掃描電鏡(SEM)、投射電鏡(TEM)和激光共聚焦掃描顯微鏡(CSLM)可以直觀觀察到生物膜表層的形態(tài)，其細(xì)胞間的連接、纖維樣多糖和細(xì)胞間質(zhì)也都清晰可見。掃描電鏡還可以觀察到生物膜內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，被認(rèn)為是觀察生物膜形態(tài)的 “金標(biāo)準(zhǔn)”。ALHEDE等[27]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)因掃描電鏡觀察要經(jīng)過復(fù)雜的樣品制備和脫水過程，使得整個(gè)生物膜的框架收縮，因此很難得到生物膜原有的三級(jí)結(jié)構(gòu)信息，而且價(jià)格昂貴，不適合做常規(guī)檢測(cè)。

原子力顯微鏡(AFM)有可以成像的能力，擁有可以到達(dá)納米級(jí)的高分辨率，可以觀察單細(xì)胞表面，且樣品制備簡(jiǎn)單，是微生物研究的有力工具[28]。但它也有一些局限性，如無法獲得大面積的掃描結(jié)果，無法觀察到生物膜柔軟的凝膠狀性質(zhì)[29]。

激光共聚焦掃描顯微鏡法(CSLM)是近年來發(fā)展起來的主要用于組織形態(tài)學(xué)研究的一項(xiàng)新技術(shù)，它可以對(duì)樣品進(jìn)行分層掃描拍攝，用較高的分辨率觀察到生物膜結(jié)構(gòu)的無創(chuàng)性影像，所以可以應(yīng)用于觀察細(xì)菌生物膜的立體結(jié)構(gòu)[30]。

2.3分子生物學(xué)法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)細(xì)菌生物膜形成機(jī)制的不斷深入研究，PCR基因檢測(cè)技術(shù)已成為一種有效的檢測(cè)方法，如De Gregorio等[31]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立了一種快速檢測(cè)血液樣本中鮑氏不動(dòng)桿菌生物膜形成相關(guān)基因的方法。ATSHAN等[32]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)生物膜形成各相關(guān)基因在生物形成過程不同時(shí)間段的表達(dá)量不同，且在不同階段表達(dá)的基因不同。PCR鑒定已經(jīng)發(fā)展為近年來廣泛應(yīng)用的一種檢測(cè)細(xì)菌體外生物膜形成能力的方法，具有簡(jiǎn)便、快速、特異性高等特點(diǎn)，可以應(yīng)用于快速檢測(cè)細(xì)菌種類及其生物膜形成相關(guān)基因[33]。

熒光原位雜交(FISH)是以熒光標(biāo)記取代核素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法，通過熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針能夠特異地和互補(bǔ)核酸序列在完整的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。BURGA等[34]設(shè)計(jì)了一種特異性高達(dá)80%的特定的寡核苷酸探針(Pedo1250)，成功的應(yīng)用于不同來源土微菌屬生物膜的原位檢測(cè)，且與掃描電鏡觀察到的生物膜形態(tài)結(jié)果一致。FISH具有快速、安全、靈敏度高、探針能長(zhǎng)期保存并能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)，但熒光標(biāo)記的DNA探針法由于受雜交親和性、細(xì)胞滲透率和靶向性的影響，使得探針分子特異性差、信噪比較低、靈敏度低。

報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，其表型易于檢測(cè)且易與內(nèi)源性背景蛋白區(qū)分。報(bào)告基因的主要優(yōu)點(diǎn)是實(shí)時(shí)性、非侵入性、高度敏感性、可靠性、可重復(fù)性、易檢測(cè)而且可以用于大規(guī)模的檢測(cè)[35]。近年熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、CLSM等成像技術(shù)的進(jìn)步，綠色、紅色熒光蛋白等新報(bào)告基因的應(yīng)用，為生物膜胞間信號(hào)傳遞及基因表達(dá)變化的研究提供了新的途徑。將報(bào)告基因技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌及生物膜的形態(tài)學(xué)研究中，通過轉(zhuǎn)入細(xì)菌及生物膜的熒光蛋白自身發(fā)光就可實(shí)時(shí)且動(dòng)態(tài)的在鏡下觀察，研究生物膜中的多種細(xì)菌及其相互影響時(shí)，也可用不同顏色的熒光蛋白分別進(jìn)行標(biāo)記，還可研究其在生物膜中的空間分布[36]。

3結(jié)論與展望

金黃色葡萄球菌在食品生產(chǎn)和加工設(shè)備表面形成的生物膜可能是一個(gè)重要食品微生物污染源，從而給食品安全埋下很大的安全隱患，因此在越來越強(qiáng)調(diào)食品安全的大環(huán)境下，迫使我們不得不加強(qiáng)研究力度去尋找控制生物膜的方法。生物膜的形成是多種因素參與的一個(gè)非常復(fù)雜的過程，雖然這個(gè)過程目前還不是很明確，但是，近年來由于分子生物學(xué)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，使得我們對(duì)生物膜的了解越來越深入，如一些結(jié)構(gòu)和調(diào)控因子在決定生物膜形成和生物膜生理學(xué)上起重要作用，因此，我們就可以對(duì)目前去除生物膜常用的物理和化學(xué)方法進(jìn)行深入探究，以確定一種能夠應(yīng)用到食品工業(yè)上的有效生物膜去除方法，也可以對(duì)一些具有抑菌作用的天然產(chǎn)物是否能夠調(diào)控某些對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成起關(guān)鍵作用的基因進(jìn)行深入研究，進(jìn)而找到一種能夠抑制金黃色葡萄球菌浮游菌和生物膜的天然物質(zhì)。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，人們對(duì)細(xì)菌生物膜的認(rèn)識(shí)將越發(fā)深入和透徹，也就可以更好的為我們控制和克服因生物膜而導(dǎo)致的食品污染及食源性疾病提供理論基礎(chǔ)。

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Perspectives on the related genes and detection methods ofStaphylococcusaureusbiofilm formation

LIU Mei-hui，LI Jian-ke，LIU Liu*

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an,Shaanxi 710119, China)

ABSTRACTStaphylococcus aureus is a pathogenic bacterium that is capable of developing biofilms on equipment surfaces during food processing and storage. Since the bioflim is difficult to remove and it can protect the bacteria embedded into it from sanitizers, it has brought huge losses and security risks for food industry. The latest research progress of the related genes of biofilm formation and the commonly used qualitative and quantitative detection method of bioflim were discussed in this paper to provide technical and theoretical support for the control of pollution and diseases caused by biofilms in the food industry.

Key wordsStaphylococcus aureus; biofilm; gene; detection method

收稿日期：2015-08-16，改回日期：2015-10-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目“沒食子酸調(diào)控福氏志賀菌mdoH基因表達(dá)對(duì)生物膜的影響控制”(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：31301472)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602045

第一作者：碩士研究生(劉柳副教授為通訊作者，E-mail: liuliu@snnu.edu.cn)。