朱玲玲，張廣文，鄭樹秀，邱瑞霞

(暨南大學 理工學院 食品科學與工程系，廣東 廣州,510632)

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白鵑梅提取物的體外抗氧化活性及黃酮類化學成分的分離鑒定

朱玲玲，張廣文*，鄭樹秀，邱瑞霞

(暨南大學 理工學院 食品科學與工程系，廣東 廣州,510632)

摘要文中對白鵑梅不同溶劑萃取物進行體外抗氧化活性實驗；在此基礎上利用薄層層析、柱層析、高效液相色譜儀進行黃酮類物質的分離、純化；質譜儀、核磁共振對所分離的化合物進行結構鑒定。實驗結果顯示：乙酸乙酯相萃取物的體外抗氧化活性相比其他相萃取物的活性大；從乙酸乙酯相萃取物中分離出3種黃酮類化合物，分別鑒定為——芹菜素(apigenin，化合物1)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside，化合物2)、蘆丁(rutin，化合物3)。

關鍵詞白鵑梅；體外抗氧化，黃酮，分離鑒定

白鵑梅(ExochordaserratifoliaS.Moore.)為薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬植物，全世界共4種，其中3種(白鵑梅、齒葉白鵑梅、紅柄白鵑梅)在我國有分布[1]。白鵑梅主要生長在我國的江蘇、浙江、安徽一帶，又名繭子花、龍柏芽。該植物在《藥物植物詞典》以及《中華本草》等書籍均有記載，其根皮、樹皮入藥，用于腰骨酸痛的治療。

白鵑梅花蕾和嫩葉均可食用，在我國民間已有悠久歷史。據(jù)《中國野菜圖譜》等文獻報道，其所含多種維生素和Ca、Fe、Zn等營養(yǎng)成分之高[2]，是許多常見蔬菜所不及的。研究表明，齒葉白鵑梅以及紅柄白鵑梅中含有豐富的黃酮類化學成分[3-4]，而黃酮類化合物是一種具有生物活性的天然有機化合物，隨著對黃酮類化合物研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有許多生理功能，如抗炎、抗病毒、抗氧化作用。

本文對白鵑梅中的黃酮類化合物進行提取分離，并對不同條件下白鵑梅萃取物進行體外抗氧化活性實驗，結果證明乙酸乙酯相提取物的體外抗氧化活性較高；根據(jù)實驗結果利用柱層析、高效液相、質譜、核磁共振等方法對白鵑梅中的黃酮類化合物進行了分離純化和鑒定。

1材料和方法

1.1材料與試劑

白鵑梅幼葉及花蕾,采于河南平頂山舞鋼市。

無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯乙酸、濃H2SO4、H2O2；FeCl3、FeCl2、VC、EDTA、Na2HPO4、鉬酸銨、FeSO4、水楊酸,均為分析純，購于天津市大茂化學試劑廠。

1.2儀器與設備

UV-9600紫外分光光度計,北京瑞利儀器有限公司;EL104電子分析天平,METTLER TOLEDD有限公司;B-260水浴鍋,上海亞榮生化儀器;RE52C52旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器;薄層色譜硅膠板(TLC),青島海洋化工集團有限公司;高效液相色譜儀Shimadzu LC-20AT ,日本島津;質譜儀,安捷倫儀器有限公司;AVANCEⅢ型超導核磁共振儀,德國Bruker公司。

1.3實驗方法

1.3.1白鵑梅的分部萃取

稱取白鵑梅5 kg，用乙醇浸泡10 d，浸泡3次；旋轉蒸發(fā)得到乙醇浸膏。然后分別用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，水依次進行萃取，每個過程重復3次；將萃取液旋轉蒸發(fā)分別得到不同萃取劑浸膏。

1.3.2白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的還原能力測定

分別配制質量濃度 20、40、60、80、100、120 μg/mL 的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，分別加入2.5 mL，0.2 mol/L，pH 6.6的磷酸鹽緩沖液；2.5 mL ，1.0%的K3Fe(CN)6溶液；50 ℃ 水浴20 min 后；加入2.5 mL ，1.0%的三氯乙酸溶液；然后，分別加入2.5 mL水和0.5 mL 質量分數(shù)0.1%的FeCl3溶液；充分反應，在700 nm 下測吸光值；以VC作為陽性對照。

1.3.3白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物總抗氧化活性測定

分別配制質量濃度為20、40、60、80、100、120μg/mL的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，取0.1 mL 樣品溶液于試管，分別加入0.6 mol/L 的濃硫酸，28 mmol/L 的Na3PO4溶液，4 mmol/L的鉬酸銨溶液各1 mL，試管密封，95 ℃ 水浴90 min ；然后室溫環(huán)境冷卻至25 ℃ ；695 nm 下測吸光值；以VC作為陽性對照。

總抗氧化活性/%=[1-(Asample/Acontrol)]×100

1.3.4白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的DPPH自由基清除活性測定

分別配制質量濃度為20、40、60、80、100、120μg/mL的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，取2 mL樣品溶液于試管，依次加入2.0 mL 6 mmol/L 的FeSO4溶液，2.0 mL 6 mmol/L 的H2O2溶液，搖勻，反應10 min ，加入2.0 mL 6 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，搖勻，反應30 min ，510 nm 下測吸光值，以 VC作為陽性參照。

清除率/%=[1-(Asample/Acontrol)]×100

1.3.5白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的金屬離子螯合能力測定[5]

分別配制質量濃度為20、40、60、80、100、120μg/mL的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物溶液，取1.0 mL的樣品溶液于試管，分別加入20 mmol/L 的FeCl2100 μL，5 mmol/L 的ferrozine溶液0.2 mL，劇烈振蕩使其充分反應，靜置10 min；在562 nm 下測其吸光值；以EDTA作為陽性對照。

金屬離子螯合活性/%=[1-(Asample/Acontrol)]×100

1.3.6白鵑梅乙酸乙酯層萃取物的分離純化

根據(jù)不同提取溶劑的體外抗氧化活性結果，對乙酸乙酯相萃取物做進一步的分離純化。首先將乙酸乙酯層浸膏(170.4 g)上硅膠(200～300目)層析柱(900 mm×45 mm)，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶0～0∶100進行梯度洗脫，洗脫液每300 mL 為餾分；結合薄層色譜(TLC)檢測，合并，濃縮，得到22個餾分。

將餾分6上硅膠(200～300目)層析柱，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=9∶1進行洗脫；將洗脫液合并濃縮利用葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)進一步分離純化，得到化合物1(23 mg )。

餾分8放置一段時間析出結晶，將晶體置出進行重結晶，得到化合物2(15 mg)。

餾分20先經(jīng)V(三氯甲烷)∶V(甲醇)進行洗脫；然后利用制備液相制備，條件為：流動相V(甲醇)∶V(水)= 45∶55；流速：1.0 mL/min；進樣量：40 μL ；波長267 nm；將制備樣品于50 ℃ 旋蒸，得到化合物3(18 mg)。

1.3.7三種化合物的薄層色譜(TLC)測定

對上述實驗所得的化合物1～化合物3分別進行薄層色譜檢測[6]，展開劑分別為：V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=6∶1、3∶1、2∶1；將硅膠板在碘缸中進行顯色，計算其Rf值。

1.3.8白鵑梅黃酮類化合物HPLC測定

將化合物1,化合物2進行高效液相色譜測定，HPLC實驗條件為：DiamonsiLC18柱(5 μm , 25 mm×1.6 mm)進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；檢測器：SPD-M20A示差折光檢測器；流動相：(化合物1)V(甲醇)∶V(水)=65∶35，(化合物2)乙腈-2%冰乙酸水溶液(體積比23∶77)；流速：1.0mL/min；檢測波長；267nm。

1.3.9利用質譜以及核磁鑒定白鵑梅黃酮類化合物的結構

根據(jù)薄層色譜(TLC)以及HPLC結果的初步推斷，化合物1～化合物3純度達到了95%以上；將化合物1,2分別利用質譜以及核磁鑒定其分子質量以及最終的結構。

2結果與分析

2.1白鵑梅不同溶劑下萃取結果

根據(jù)不同溶劑萃取分別得到石油醚萃取物(PF)200.04g，乙酸乙酯萃取物(AF)170.4g，正丁醇萃取物(BF)42.49g，水層萃取物(WF) 306.98g。

2.1.1白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的還原性

實驗分別對不同濃度的白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物進行了還原性測定；還原力強的樣品可以使Fe3+轉化成Fe2+；也可以和自由基互相作用從而阻斷鏈式反應；可以通過測定700nm波長下生成的普魯士藍的吸光值進行檢測；吸光值越大，樣品還原力越強[7]。由圖1可以看出，不同溶液的提取物的還原力的大小為：VC>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>水層萃取物>乙醇粗提物>石油醚萃取物；由此可以看出，乙酸乙酯層萃取物的還原能力最強，說明其中還原劑含較多良好的電子供體；石油醚層萃取物的還原力相對最差。

圖1　白鵑梅乙醇粗提物以及分步萃取物的還原力Fig. 1　Reducing power of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.1.2白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的總抗氧化活性

實驗方法的原理是樣品中的還原劑能將六價鉬還原為五價鉬，而五價鉬與磷酸鹽反應生成綠色的磷酸鉬，該化合物在695 nm 下有最大吸收峰[8]。由圖2可以看出，白鵑梅各層萃取物都有一定的抗氧化活性，并且隨著濃度增加各層總抗氧化活性遞增；各層萃取物總抗氧化活性的大小順序為：VC>乙酸乙酯萃取物>乙醇粗提物>正丁醇萃取物>水層萃取物>石油醚層萃取物。各層萃取物中，乙酸乙酯萃取物的吸光值相應最大，其總抗氧化能力最強，乙醇粗提物層總抗氧活性高于正丁醇層，石油醚層萃取物的吸光值相應最小，總抗氧化能力最弱。

圖2　白鵑梅乙醇粗提物及其分步萃取物的總抗氧化活性Fig. 2　Total antioxidant activity of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.1.3白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的DPPH自由基清除活性

當DPPH遇到自由基清除劑時，其結構中的孤對電子被配對而退色，在510 nm 處的吸光值變小，且變小程度與樣品中自由基清除劑成正比[9]，可以由此作為判定標準進行結果判定。由圖3可以看出，白鵑梅各層萃取物對DPPH都有一定的清除能力，并且隨著濃度的增加，清除能力也相應的增大；白鵑梅各層萃取物DPPH自由基清除活性的大小順序為：VC>乙酸乙酯層萃取物>正丁醇層萃取物>水層萃取物>乙醇粗提物>石油醚層萃取物；乙酸乙酯層清除能力最強，石油醚層相應的最弱。

圖3　白鵑梅乙醇粗提物及其分步萃取物的DPPH自由基清除活性Fig. 3　DPPH free radical scavenging effect of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.1.4白鵑梅乙醇粗提物及分步萃取物的金屬離子螯合活性

由圖4可以看出，白鵑梅各層萃取物都有一定的螯合能力，并且與濃度的大小呈正相關關系；各層萃取物金屬離子螯合能力大小順序：EDTA>乙酸乙酯層萃取物>正丁醇層萃取物>水層萃取物>乙醇粗提物>石油醚層萃取物。即乙酸乙酯層最大，正丁醇層次之，石油醚層最小。

圖4　白鵑梅乙醇粗提取以及分步萃取物的金屬離子螯合活性Fig. 4　Ferrous ion chelating capacity of the ethyl acetate fraction (AF),butanol fraction(BF),water fraction (WF),crude ethanol fraction (EF)and petroleum ether fraction(PF) from Exochorda racemosa

2.2三種化合物的薄層層析結果

圖5是對應化合物1～化合物3的薄層層析板在碘缸中顯色的結果。圖1硅膠板在紫外下觀察有黃色熒光；Rf1=0.46。圖2硅膠板在紫外下棕黃色熒光Rf2=0.56。圖3是蘆丁標準品與化合物3的對照，TLC檢測結果與蘆丁對照品Rf值以及斑點顏色一致；Rf3=0.35。

圖5　三種化合物的薄層色譜圖Fig.5　P-silica gel TLC of compounds 1 , 2 , 3

2.3化合物1,化合物2的HPLC結果

從圖6-A可以看出化合物1在流動相為V(甲醇)∶V(水)=65∶35條件下，在HPLC色譜圖上保留時間為5.403 min。圖6-B可以看出化合物2在流動相為V(乙腈)∶V(2%冰乙酸)=23∶77條件下在HPLC色譜圖保留時間為8.887 min。

圖6　化合物1,2的高效液相色譜圖Fig.6　HPLC of compound 1, 2

2.4化合物1的結構鑒定

圖7　化合物1的氫譜、碳譜圖Fig.7　1H NMR , 13C NMR of compound 1

化合物1為淡黃色針狀晶體(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應結果呈陽性。由MS結果可知，ESI-MS:m/z=269.2[M-H+]，271.0[M+H+]，分子式為C15H10O5。由圖7-A可以看出1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.66(1H,5-OH),7.92(2H,d ,J=9.0 Hz )，6.96( 2H,d,J=9.0 Hz )，6.68( 1H,s )，6.48(1H,d,J=2.0 Hz)，6.12(1H,d,J=2.0 Hz)，其中6.91 (2H,d,J=9.0 Hz)可以推出B環(huán)有對稱結構；由圖7 B可以看出，13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:182.52(C-4)，164.91(C-2)，164.63(C-7)，161.84(C-4′)，161.36(C-5)，158.04(C-9)，128.06(C-2′,6′)，121.87( C-1′)，115.62(C-3′,5′)，103.92(C-10)，102.44(C-3)，98.72(C-6)，93.63(C-8)；由以上數(shù)據(jù)根據(jù)文獻[10]報道，可以推出該物質為芹菜素(apigenin)，其結構式為：

2.5化合物2的結構鑒定與分析

圖8　化合物2的氫譜、碳譜圖Fig.8　1H NMR , 13C NMR of compound 2

化合物2為黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應結果呈陽性，F(xiàn)eCl3反應呈藍色。由MS結果可以看出，ESI-MS:m/z=431.3[M-H+]，433.4[M+H+]。分子式為C21H20O10。由圖8-A可以看出，1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:3.32-3.97 (6H, m)，5.08(1H, d,J=7.3 Hz)，6.51(1 H, d ,J=2.0 Hz)，6.67(1H ,d ,J=2.0 Hz)，6.82(1H ,s)，6.94(2H, d ,J=8.7 Hz)，8.07(2H ,d,J=8.7 Hz)；其中，5.08(1H, d,J=7.3 Hz)是糖的端基氫信號。由圖8-B可以看出，13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ:61.07(C-6")，69.87 (C-4")，73.33 (C-2")，76.46 (C-3")，77.00 (C-5")，94.67 (C-8) 99.79 (C-1")，100.23 (C-6)，102.74 ( C-3)，105.69 (C-10)，115.64 (C-3′,5′)，121.69 (C-1′)，128.24 (C-2′,6′)，157.57 (C-9)，161.49 (C-5)，161.53 (C-4′)，163.42 (C-7)，165.37 (C-2)，182.69 (C-4)。由碳譜數(shù)據(jù)進一步推測出7號位有葡萄糖，氫譜及碳譜數(shù)據(jù)與文獻[11]數(shù)據(jù)相符，故推測該化合物為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside)。結構式為：

2.6化合物3的結構鑒定及分析

為黃色粉末(甲醇)，鹽酸-鎂粉反應結果呈陽性。由質譜結果可知，ESI-MS:m/z=609.5[M-H+]，633.4[M+,Na+]。通過UV紫外光譜掃描，在253,365 nm處有吸收，所以鑒定其為蘆丁(rutin)。結構式為：

3結論

根據(jù)實驗結果可以看出，乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，水5種溶劑對白鵑梅進行提取得到的提取物中，均有一定的抗氧化活性，但經(jīng)過比較，乙酸乙酯相體外抗氧化活性相對最大。通過實驗對白鵑梅黃酮類化學成分進行分離、純化、鑒定初步得到了3種黃酮類化合物分別為芹菜素(apigenin)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside)、蘆丁(rutin)。

白鵑梅中含有多種具有活性的化學成分，本實驗初步分離純化得到3種黃酮類化學成分；為以后提取分離純化得到更多的有效成分提供了基礎。

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Exochorda racemosa extract’s antioxidant evaluation and its flavonoids components analysis

ZHU Ling-ling,ZHANG Guang-wen*, ZHANG Shu-xiu, QIU Rui-xia

(Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

ABSTRACTThe antioxidant activity of exochorda racemosa extracts by different extracting solution was evaluated. Then, TLC , acolumn chromatography and HPLC were used to separate and purify the extracts. MS and NMR were used to identify the chemical components of the extracts. Results showed that: (1) the vitro antioxidant activity of extract in ethyl acetate was higher than in others ; (2) three compounds were isolated and identified as apigenin, apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside and rutin.

Key wordsExochorda racemosa; vitro antioxidant ; flavonoids ; isolation and identification

收稿日期：2015-06-24，改回日期：2015-09-06

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602039

第一作者：碩士研究生(張廣文副教授為通訊作者)。