王林鳳　康　毅　魏國(guó)玲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院( 咸陽(yáng) 712000)

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·方藥縱橫·

通脈舒絡(luò)合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

王林鳳康毅魏國(guó)玲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院( 咸陽(yáng) 712000)

摘要目的：確立通脈舒絡(luò)合劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：色譜柱：ThermoC18(250mmX4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈—0.1%磷酸溶液(14:86)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；用薄層色譜法(TLC)對(duì)黃芪、赤芍、水蛭、當(dāng)歸、川芎進(jìn)行鑒別研究；用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定通脈舒絡(luò)合劑中芍藥苷濃度。結(jié)果：TLC和 HPLC中成分無(wú)干擾；芍藥苷濃度在0.246μg～1.32μg范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為100.5%，RSD=1.08%。結(jié)論：鑒別和含量測(cè)定方法可靠、結(jié)果準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，能有效控制通脈舒絡(luò)合劑質(zhì)量。

主題詞通脈舒絡(luò)合劑芍藥苷色譜法，高壓液相

通脈舒絡(luò)合劑是國(guó)醫(yī)大師張學(xué)文教授治療腦病經(jīng)驗(yàn)方，由多味中藥經(jīng)提取制成的純中藥制劑，具有益氣活血，化瘀通絡(luò)功效。該組方在二十世紀(jì)七十年代末被制成通脈舒絡(luò)輸液劑，應(yīng)用于臨床，主治腦血栓形成，腦出血恢復(fù)期，療效確切。在原輸液劑處方基礎(chǔ)上加味制成了通脈舒絡(luò)合劑，運(yùn)用于臨床，療效滿意，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有性狀和檢查項(xiàng)。為更進(jìn)一步控制其質(zhì)量，保證療效，對(duì)黃芪、赤芍、水蛭、當(dāng)歸、川芎進(jìn)行了薄層鑒別研究；對(duì)赤芍中主要有效成分芍藥苷進(jìn)行定量測(cè)定研究，建立了通脈舒絡(luò)合劑定性和定量標(biāo)準(zhǔn)，為其控制質(zhì)量提供有效依據(jù)。

1材料

1.1儀器設(shè)備日本島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀(四元泵)；SPD-10A(V)VP紫外檢測(cè)器；色譜柱ThermoC18(250mmX4.6mm,5μm)；KQ-3200E超聲清洗儀；METLER AE-240電子分析天平；PHS-3C型PH酸度計(jì)。

1.2對(duì)照藥材當(dāng)歸、川芎、赤芍由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3對(duì)照品芍藥苷、黃芪甲苷由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.4通脈舒絡(luò)合劑本院制劑室提供。

1.5試劑乙腈、甲醇為色譜純；水為注射用水；其它為分析純。

2方法

2.1性狀本品為棕褐色液體，氣微腥，味微苦、澀。

2.2檢查

2.2.1 pH值：在室溫下測(cè)定，pH值范圍為5.0～7.0 。

2.2.2相對(duì)密度：在室溫下測(cè)定，相對(duì)密度范圍為1.08～1.15 。

2.2.3其它：應(yīng)符合合劑項(xiàng)下有關(guān)各項(xiàng)規(guī)定(《中國(guó)藥典》2010年版附錄ID)。

2.3定性鑒別

2.3.1 黃芪的鑒別：取本品30mL，先用水飽和的正丁醇提取3次(30mL/次)，3次正丁醇液合并；然后用氨試液洗2次(30mL/次)；再用正丁醇飽和的水洗滌2次(20mL/次)，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解，制成供試品溶液，并同法制成缺黃芪的溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品10mg，置10 mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度成為對(duì)照品溶液(1mg/mL)。依照薄層色譜法試驗(yàn)依法操作，見(jiàn)圖1。

1-黃芪甲苷對(duì)照品；2、3、4-供試品；5-缺黃芪的陰性對(duì)照點(diǎn)樣量：5μL 展開(kāi)劑：氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置12h以上的下層溶液顯色劑：10%硫酸乙醇溶液結(jié)果：陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾

圖1黃芪TLC圖譜

2.3.2赤芍鑒別:取本品30mL，加水飽和正丁醇萃取2次(20mL/次)，正丁醇用水洗滌2次(20mL/次)，水浴蒸干后用2mL甲醇溶解成供試品溶液，按上述方法制成缺赤芍的對(duì)照溶液。取赤芍對(duì)照藥材2.4g，用30mL乙醇，浸泡4h，超聲30min，濾液揮干，用甲醇1mL溶解成對(duì)照藥材溶液。另取芍藥苷10 mg，置10mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度成對(duì)照品溶液(1mg/mL)。依照薄層色譜法試驗(yàn)依法操作，見(jiàn)圖2。

1、2-供試品；3-赤芍藥材對(duì)照；4-芍藥苷對(duì)照品；5-缺赤芍的陰性對(duì)照點(diǎn)樣量：5μL展開(kāi)劑：氯仿-乙酸乙酯-甲醇-濃氨溶液(8∶1∶4∶1)顯色劑：5%香草醛硫酸溶液結(jié)果：陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾

圖2赤芍TLC圖譜

2.3.3水蛭鑒別:取本品10mL，加乙醇20mL，超聲30min，過(guò)濾液為供試品溶液，按上述方法制成缺水蛭的溶液。取水蛭對(duì)照藥材1.0g，按上法制成對(duì)照藥材溶液。依照薄層色譜法操作，見(jiàn)圖3。

1-缺水蛭的陰性對(duì)照；2-水蛭藥材對(duì)照；3、4-供試品點(diǎn)樣量：5μL展開(kāi)劑：環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)顯色劑： 10%的硫酸乙醇溶液結(jié) 果：陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾

圖3水蛭TLC圖譜

2.3.4川芎鑒別[1-2]：取本品30 mL，加乙醚萃取2次(30mL/次)，把乙醚液揮干后用1mL乙酸乙酯溶解成為供試品溶液，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取川芎對(duì)照藥材1g，加乙醚15mL，浸漬4h以上，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)依法操作，見(jiàn)圖4。

1-川芎藥材對(duì)照； 2、3、4-供試品；5-缺川芎的陰性對(duì)照點(diǎn)樣量：2μL展開(kāi)劑：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)檢 視：365nm紫外光燈下結(jié) 果：陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾

圖4川芎TLC圖譜

2.3.5 當(dāng)歸薄層色譜鑒別：取本品30mL，加乙醚萃取2次(25mL/次)，乙醚液蒸干，殘?jiān)右掖?mL溶解，制成供試品溶液，按照上述方法制成缺當(dāng)歸的溶液。取1g當(dāng)歸對(duì)照藥材，用15mL乙醚，超聲15min，依照上法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)依法操作，見(jiàn)圖5。

1、 2-供試品 3-當(dāng)歸藥材對(duì)照 4-缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照點(diǎn)樣量：3μL展開(kāi)劑：環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)檢 視：365nm紫外光燈下 結(jié) 果：陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾

圖5當(dāng)歸TLC圖譜

2.4芍藥苷的含量測(cè)定

2.4.1 實(shí)驗(yàn)條件流動(dòng)相：乙腈—0.1%磷酸溶液(14:86)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；測(cè)定量：10μL；理論板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

2.4.2 芍藥苷對(duì)照品溶液制備:取芍藥苷對(duì)照品66.0 mg，置20 mL量瓶中，加20%甲醇溶解定溶至刻度，再精取1mL置5 0mL量瓶中定溶至刻度制成對(duì)照品溶液，即得。

2.4.3 樣品溶液的制備：精取樣品10mL，置有塞子的錐形瓶中，精加50mL甲醇，蓋塞，稱(chēng)重量，然后超聲20min，取出放冷，再稱(chēng)定其重量，用稀釋劑補(bǔ)足減少的重量，搖勻后過(guò)濾，精取續(xù)濾液10mL，水浴蒸干后用20%甲醇定溶至10mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.4.4 陰性溶液制備：精密量取缺赤芍的制劑10mL，按樣品溶液制備方法制得缺赤芍的對(duì)照溶液。

2.4.5 分析方法：分別取芍藥苷對(duì)照品、樣品和陰性對(duì)照溶液，過(guò)濾，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖6、7、8。

通過(guò)在以上上述色譜條件下實(shí)驗(yàn)，缺赤芍的對(duì)照溶液對(duì)芍藥苷成分的測(cè)定無(wú)干擾。

2.4.6 線性考察：吸取芍藥苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣，依次進(jìn)樣4μL，8μL，10μL，12μL，16μL，20μL，測(cè)峰面積，以峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得方程A=2 124 361.8C+38 609.71(r=0.999 9)。表明樣品溶液在0.264μg～1.32μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 精密度考察：吸取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積,得RSD為1.07%，顯示精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性考察：取供試品溶液，分別在0，4，6，8，12，16h測(cè)定,RSD為0.38%，表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.9 回收率試驗(yàn)：精密量取已知濃度樣品9份，每份1mL，將9分樣品分成3組，每組加入芍藥苷對(duì)照品溶液分別為1mL、2mL、3mL，測(cè)定回收率，見(jiàn)表1。

表1　芍藥苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.4.10 樣品含量：取各批號(hào)樣品按“2.4.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算芍藥苷含量。批號(hào)20140521,20140522,20140523分別為0.35mg·mL-1, 0.36mg·mL-1,0.34mg·mL-1。

3討論

3.1本品是一個(gè)中藥復(fù)方制劑，藥味多，化學(xué)成分復(fù)雜，影響鑒別干擾因素多，要想得到理想的色譜圖譜，需要經(jīng)過(guò)前處理才能實(shí)現(xiàn)。本研究通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，對(duì)方中黃芪、赤芍、水蛭、當(dāng)歸、川芎得到了較好薄層鑒別；考慮到當(dāng)歸、川芎含有相同化學(xué)成分，為能在一塊板上同時(shí)進(jìn)行展開(kāi)，曾實(shí)驗(yàn)多種提取方法和展開(kāi)劑，如石油醚(30～60℃)-三氯甲烷-三乙胺(6∶2∶0.5)[3]、

苯-冰醋酸-甲醇(30∶1∶3)[4]等均未能達(dá)到理想效果。

3.2在當(dāng)歸藥材薄層色譜鑒別時(shí)，分別用了正己烷-乙酸乙酯(9∶1)[5]、環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，兩者均能分離出清晰斑點(diǎn)，鑒于正己烷比環(huán)己烷毒性大，對(duì)人體危害嚴(yán)重，故用環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑。

3.3在質(zhì)量濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，本想測(cè)定黃芪甲苷、芍藥苷，但由于黃芪甲苷屬四環(huán)三萜類(lèi)皂苷，在紫外區(qū)201nm波長(zhǎng)處有弱的末端吸收。用UV-HPLC法干擾大，ELSD-HPLC比較適合之，而我們實(shí)驗(yàn)條件達(dá)不到，只能測(cè)定后者的有效成分作為定量指標(biāo)。

3.4經(jīng)3批樣品中芍藥苷測(cè)定，芍藥苷濃度在0.34 mg·mL-1～0.36mg·mL-1，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中通脈舒絡(luò)合劑藥材來(lái)源，以及提取純化過(guò)程、儲(chǔ)藏環(huán)境等因素影響，故暫定本品：每1mL含芍藥苷不得少于0.30mg。

參考文獻(xiàn)

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(收稿2015-11-13；修回2015-12-16)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.04.055

*陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院科研基金項(xiàng)目(2014-27)