楊吉慶，黃兆樣，梁　杰，夏志遠，翟仙敦，莫耀南

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測定端粒長度推斷法醫(yī)學年齡的研究進展

楊吉慶1，黃兆樣2，梁杰3，夏志遠4，翟仙敦4，莫耀南4

摘要：目的對不同組織細胞端粒長度與法醫(yī)學年齡關系的研究進行綜述，為相關研究提供參考。方法參考近年來有關文獻，對端粒的結構及功能、端粒長度的測定方法、不同組織細胞端粒長度與法醫(yī)學年齡的關系，以及端粒長度的影響因素等方面進行系統(tǒng)回顧。結果不同組織細胞端粒長度與法醫(yī)學年齡關系顯著。結論測定端粒長度對于法醫(yī)學年齡推斷具有重要意義。

關鍵詞：法醫(yī)學；年齡推斷；端粒

2.海南省保亭縣公安局, 海南保亭572300

3.海南省五指山市公安局，海南五指山 572200

4.河南科技大學法醫(yī)學院，河南洛陽 471003

法醫(yī)學個體識別中，準確的年齡資料可以為刑事案件的偵破提供重要的信息。目前通過骨齡檢測尚可對個體法醫(yī)學年齡進行大致推斷，然而利用現(xiàn)場遺留下的軟組織碎塊、各種斑痕等生物性檢材進行法醫(yī)學年齡推斷，目前仍然沒有一套成熟可靠的方法。端粒是存在于各種組織細胞內，由染色體末端重復序列和結合蛋白組成的帽狀結構，隨著個體年齡的增加，端粒長度也會隨之縮短，因此利用現(xiàn)場生物檢材端粒長度推斷法醫(yī)學年齡是一種方法。本文對有關文獻加以綜述，重點回顧端粒結構、端粒長度的測量方法、端粒長度與年齡的關系、端粒長度改變的影響因素等內容，為利用端粒長度推斷法醫(yī)學年齡的相關研究提供思路。

1端粒研究概述

1.1端粒的結構和功能

端粒是由位于染色體末端的重復序列和結合蛋白組成。目前發(fā)現(xiàn)，序列的重復單位在不同物種之間并不完全相同，例如最早發(fā)現(xiàn)的重復單位是位于四膜蟲端粒上的CCCCAA六堿基序列，而后來發(fā)現(xiàn)人和其他哺乳動物的端粒重復單位則是TTAGGG[1]。而有些生物體，如草履蟲，其端粒是以由TTGGGG和TTTGGG共同組成，而酵母菌端粒則是由TG、TGG和TGGG組成。但由于大多數(shù)端粒的重復單位都含有3個或3個以上的G，所以含有3個或3個以上G的這條單鏈也稱作多G鏈(stand G enriched，G-rich strand)，并由其構成端粒3’末端。人類端粒為雙鏈結構，并且在3’末端，多G鏈比互補鏈長，而突出這段多G鏈通過氫鍵作用將鏈中每4個G固定在同一平面內，形成G-四連體結構(G-quadruplexes)。這一結構對DNA的復制和端粒的延長有阻礙作用[2]。而端粒整體經過卷曲、回環(huán)形成端粒環(huán)(telomere loops,T-loops)，從而將染色體尾端隔離；而端粒環(huán)最尾端單鏈DNA結構嵌入端粒雙鏈DNA中形成一段三鏈結構，這一結構命名為置換環(huán)(displacement loop,D-loop)[3]。因此，端粒的這種結構對維持染色體結構的穩(wěn)定、防止染色體端與端的融合起著重要作用。

端粒的作用還依賴于端粒結合蛋白的參與。端粒結合蛋白(shelterin telomeric binding protein)即6個蛋白的復合體，由TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1和POT1組成。端粒結合蛋白的主要功能為抑制染色體末端DNA損壞應答機制的激活和控制端粒酶對染色體末端的作用。具體來說，TRF1對端粒DNA片段具有特異識別功能，限制端粒酶對端粒的延長作用[4]；TRF2對于穩(wěn)定多G鏈結構，防止端粒融化具有重要作用；RAP1可以調節(jié)NF-κβ介導通路[5]；TIN2具有抑制TRF1多聚ADP核糖基化作用[6]；TPP1具有吸引端粒酶的作用[7]；而PTO1在端粒酶活性的抑制劑或激活劑，阻止端粒融合，抑制DNA修復系統(tǒng)功能等方面具有重要作用[8]。

端粒功能異常時，染色體末端之間會發(fā)生融合，從而激活“斷裂-融合-橋接”循環(huán)(B/F/B circle)，直至染色體得到新的端粒。目前發(fā)現(xiàn)在著絲粒和染色體末端靠近末端也發(fā)現(xiàn)有重復序列[9]，這種序列被稱為間質端粒序列(interstitial telomeric sequences，ITSs) ，可能與端粒融合和染色體易位有關。

1.2端粒長度的影響因素

端粒長度受很多因素影響，大致可以分為社會心理因素、行為習慣因素、環(huán)境因素、腫瘤和疾病因素以及其他因素。有研究表明，短時間暴露于污染的環(huán)境中，可以使白細胞端粒長度增加，而長期暴露于污染的環(huán)境中，則使白細胞端?？s短。前者認為端粒長度增加與短時間的炎癥反應有關，而后者端粒長度縮短與長期的氧化應激有關[10]。也有實驗將酵母菌暴露于不同的生長環(huán)境中，其中高溫和咖啡因等刺激能使酵母菌端粒變短，乙醇等刺激能使其端粒變長[11]。也有研究表明激光(gamma=632.8 nm,P=2 mW)可以減慢端粒變短速度[12]。而堅持高有氧運動可以延緩端粒長度的縮短速度[13]。腫瘤細胞由于端粒酶的活性被激活，所以其端粒可維持在一定的長度而不發(fā)生變化[14]。越來越多的疾病被報道與端粒長度有關，如先天性角化不良、特發(fā)性肺纖維化、再生障礙性貧血、冠狀動脈疾病、心衰等[15-16]。

1.3端粒長度的測量方法

國內外測量端粒的長度的方法主要有Southern Blot、PCR、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridisation,FISH)以及在此基礎上改進的方法如單端粒長度分析(single telomere length analysis, STELA)、實時定量PCR(Q-PCR)、單染色體多通路實時定量PCR(monochrome multiplex Q-PCR，MMQPCR)、定量熒光原位雜交(quantitative fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)以及流式細胞熒光原位雜交(Flow-FISH)等。其中，Southern Blot為第一代端粒測量技術，適合于130左右的樣本量，常常被作為評定新方法優(yōu)劣的標準。而Q-PCR是唯一可以實現(xiàn)高通量的技術，適合于大樣本量的研究，如對流行病學的研究、新藥物的篩選等。Flow-FISH可同時分析多種血細胞，適合于20～50樣本量。Q-FISH可以進行單細胞端粒長度的測量，適合5～10的樣本量。MMQPCR可以進行單染色體端粒長度的測量。STELA可以進行單個端粒長度的測量，適合1～5的樣本量。

不同方法優(yōu)缺點比較具體如下：Q-PCR是目前唯一可實現(xiàn)高通量的技術，適合大樣本的研究；缺點為結果準確性相對較低，不適合精密測量。MMQPCR是基于Q-PCR的一個新版本，可在不同拷貝數(shù)下對多組DNA模板進行研究，如對細胞mtDNA、rDNA、Alu DNA拷貝數(shù)目的研究[17]；Southern Blot為端粒長度測量的第一代技術，常作為評判新測量技術的標準。缺點是DNA需要總量大，需要來自105個以上細胞的基因組，對于非常短的端粒相對不敏感，所得結果為所有染色體端粒的平均長度，并非某個染色體端粒的長度[18]。Flow-FISH可準確測量單個細胞的平均端粒長度，并可用于多種細胞端粒長度的測量，目前為端粒長度提供了最廣泛的數(shù)據(jù)參考資料，并且是第一個利用端粒長度參與臨床診斷的技術；缺點為難以確定未知細胞清洗條件；為了保護細胞表面抗原，只能選擇同種固定液的新鮮血液樣品[19]。STELA最大的優(yōu)點為可以在pg數(shù)量級或50個細胞左右提供可靠的端粒長度結果，所以適用于稀罕類型細胞端粒長度測量；缺點為單個染色體端粒長度不能代表整個細胞端粒長度水平，而且僅限于于XpYp, 2p, 11q, 12q 和17p的檢測；而且對于較長端粒檢測能力有限，一般上限為20 kb[20-22]。

2端粒長度與法醫(yī)學年齡的關系

2.1端粒長度推斷法學年齡的理論基礎除大腦皮質、灰質、心肌細胞、生殖細胞外，人體幾乎所有體細胞端粒長度會隨時間的延長而縮短。假設某種體細胞端粒長度隨時間均勻縮短，那么可以通過測量該細胞端粒初始長度和端粒年縮短速率來推算法醫(yī)學年齡。有研究表明新生兒時的白細胞、臍動脈和包皮三者端粒長度是同步的，而正常大腦皮、髓質和心肌細胞端粒長度在個體一生變化不明顯[23]。所以端粒初始長度可以用新生兒體細胞端粒長度或者腦皮、髓質或者心肌細胞端粒長度來代替。假設某種體細胞端粒長度隨時間變化不均勻，呈現(xiàn)一定的時間階段性，那么除了需要測量該種體細胞端粒初始長度，還需要測量該體細胞端粒的終止長度，而終止長度可以用百歲老人相應體細胞長度來代替。在此基礎上還需要測量不同時間階段該細胞端粒長度的平均值。目前對端粒長度研究最多的國家是日本，其所得的大量實驗數(shù)據(jù)表明，不同種類的體細胞端粒長度隨時間呈階段性變化趨勢。在進行端粒長度的法醫(yī)學年齡推斷時，還需要考慮種族性別是否能帶來的端粒長度的變異，有研究表明中國漢族和藏族外周血白細胞端粒長度變化并無差異，但性別之間存在階段性差異，認為在0.1～14歲和65歲以上存在性別差異，其他年齡不存在明顯差異[24]。

2.2法醫(yī)常見檢材的端粒長度變化規(guī)律法醫(yī)學最常見尸體檢材有心、肺、肝、脾、腎、胰、腦、胃腸、喉頭氣管、甲狀腺、及腎上腺等。其中正常腦皮、灰質、心肌細胞端粒長度終身變化不明顯，但對于有心肌肥大的心肌細胞端粒長度年縮短率為20 bp[25]。其他組織器官端粒長度隨時間程序階段性變化趨勢，且所有端粒長度年縮短率在100 bp以下，以甲狀腺和甲狀旁腺年縮短率最大。部分組織器官端粒長度變化數(shù)據(jù)見表1。

表1　不同組織細胞端粒長度

3端粒長度在法醫(yī)學應用展望

犯罪現(xiàn)場遺留的血跡、精斑、唾液、毛發(fā)、軟組織等常見的法醫(yī)物證，對于個體識別起著重要的作用，準確測量這類檢材端粒的長度，對于犯罪嫌疑人的甄別、偵查范圍的劃分均具有重要意義。Tsuji[32]等人研究表明，只有現(xiàn)場環(huán)境下DNA能夠很好保存，可以進行粗略年齡推斷，年齡=-0.0095y+148.9±7.037(y：平均TRF長度)。也有研究表明[33]，冰凍融化和4 ℃保存4 d的血液，測得結果與直接靜脈抽血后所測結果一致。但該方法測量干燥的血跡中的全血和單核細胞的端粒長度，發(fā)現(xiàn)兩者結果明顯高于指尖取血或直接靜脈抽血所得結果。對于精子端粒長度的研究，目前認為年齡大的男性，其精子端粒長度反而長于年齡小的個體[34]。目前對于唾液斑中的口腔上皮細胞及頭發(fā)毛囊端粒長度的研究數(shù)據(jù)很少。總體而言，血跡、精斑、唾液及毛發(fā)等常見法醫(yī)物證的端粒長度測量方法及相關數(shù)據(jù)都不夠完善，有待于進一步研究。

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作者單位：1.北京市紅十字會急診搶救中心司法鑒定中心，北京 100192

Review of Telomere Length for Forensic Age Estimation

YANG Ji-qing1, HUANG Zhao-yang2, LIANG Jie3, XIA Zhi-yuan4, ZHAI Xian-dun4, MO Yao-nan4

(1.Forensic Expertise Center of Beijing Red Cross Emergency,Beijing 100192,China; 2.The Public Security Bureau of Baoting County,Baoting 572300,China; 3.The Public Security Bureau of Wuzhishan City,Wuzhishan 572200,China; 4.College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo review the researches on the telomere length in different tissues or cell and its correlation to forensic age estimation. MethodsA systematic review was made by referring the latest literatures on the structure of telomere, the methods for measuring telomere length, its correlations to forensic age estimation as well as the influencing factors etc. ResultsTelomere length in different tissues or cells was significant correlation to forensic age estimation. ConclusionDetermination of telomere length is very helpful in forensic age estimation.

Key words:forensic medicine；age estimation；telomere

文章編號：1672-688X(2016)02-0156-05

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.027

中圖分類號：DF795.1

文獻標志碼：A

基金項目：河南省基礎與前沿課題(112300410082)
河南科技大學基金資助項目(09001309，13000914，13000696)

收稿日期：2016-03-06

作者簡介：楊吉慶(1983-)，男，河南項城人，法醫(yī)師，從事法醫(yī)臨床和法醫(yī)病理學鑒定工作。

通信作者：莫耀南，男，博士，教授，碩士研究生導師，E-mail：forensic@haust.edu.cn