馬文靜毛吾蘭?買買提依明張盼盼斯依提?阿木提劉鳳霞薛志琴蔣 萍阿萊?巴合提汗阿地力江?伊明**

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室; 3. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室; 4. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

·論 著·

基于iTRAQ標(biāo)記結(jié)合IPA生物分析平臺篩選異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

馬文靜1毛吾蘭?買買提依明2張盼盼3斯依提?阿木提3劉鳳霞3薛志琴3蔣 萍4阿萊?巴合提汗3阿地力江?伊明3**

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室; 3. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室; 4. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

目的 應(yīng)用 iTRAQ 標(biāo)記技術(shù)結(jié)合IPA生物分析平臺，篩選異常黏液質(zhì)型陽痿病證特異性差異表達蛋白候選標(biāo)志物，并探討其分子機制。方法 建立異常黏液質(zhì)證候模型，并篩選陽痿病證模型后，分為正常組（N）、證候組（B1）和病證組（A1）共3組（n=10），分離血清， 進行iTRAQ標(biāo)記結(jié)合LC-MS-MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析，應(yīng)用IPA在線生物平臺對異常黏液質(zhì)型陽痿病證組大鼠血清差異表達蛋白進行蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析、生物功能分析、典型通路分析和生物標(biāo)志物篩查分析。結(jié)果 通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)獲得61種異常黏液質(zhì)型陽痿病證血清差異蛋白，IPA 分析結(jié)果為，候選差異表達蛋白質(zhì)中6種與血管內(nèi)皮功能相關(guān)；3 種與平滑肌活動相關(guān)；10種與炎癥相關(guān)。參與的主要生物學(xué)過程為損傷反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和防御反應(yīng)等，涉及的主要通路為LXR/RXR通路和FXR/RXR通路等，并獲得與勃起功能障礙疾病相關(guān)的標(biāo)志物4個，分別是C反應(yīng)蛋白、血管緊張素原、T-激肽原1以及β-2-糖蛋白1。結(jié)論 炎癥和血管內(nèi)皮功能改變可能在該病證發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用， 上述4種蛋白可能可以作為異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠與勃起功能障礙疾病相關(guān)的血清候選差異蛋白。

異常黏液質(zhì); 陽萎; IPA 生物信息學(xué)分析; 血清生物標(biāo)志物

陰莖勃起作為一種正常的生理反應(yīng)，是在內(nèi)外信息刺激下，由多種生物活性因子綜合調(diào)節(jié)的神經(jīng)-血管性生物活動。勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED），指男子陰莖不能勃起或不能維持足夠勃起而完成滿意性生活的病癥，并可伴發(fā)早泄，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中又稱陽痿， ED發(fā)生的具體機制可因內(nèi)分泌、神經(jīng)、血管、營養(yǎng)和環(huán)境等各種內(nèi)外因素，或（和）全身性疾病與局部陰莖疾病影響陰莖勃起相關(guān)環(huán)節(jié)而發(fā)生。

維吾爾醫(yī)學(xué)（維醫(yī)）是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一顆靚麗瑰寶，在長年的維醫(yī)臨床實踐中，對生殖疾病表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢，并以臨床療效著稱。本研究以陽痿維醫(yī)臨床4種證型中發(fā)病率最高的異常黏液質(zhì)型陽痿為切入點，再依據(jù)維醫(yī)理論，“病因”造模理念指導(dǎo)下，建立異常黏液質(zhì)型陽痿病證動物模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)中的iTRAQ 標(biāo)記技術(shù)，對該病證模型大鼠血清特異性差異表達蛋白標(biāo)志物進行了鑒定與篩選，并結(jié)合IPA（Ingenuity PathwayAnalysis）生物分析平臺分析了該病證發(fā)生和發(fā)病機理，尋找疾病候選蛋白，開展蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析、生物功能分析、典型通路分析和生物標(biāo)志物篩查分析。為建立該病證特異性血清蛋白標(biāo)志物體系，開展陰莖勃起功能相關(guān)的蛋白及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定了基礎(chǔ)，具體報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

隨機選取具有正常性功能的雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠70只（由交配實驗和陰莖勃起實驗證實），體質(zhì)量（195±16）g；雌性大鼠20只，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

二、實驗試劑與材料

濕寒性飼料（新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心制備）；阿撲嗎啡（Apomorphine，APO，美國Sigma公司）；黃體酮（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：I20804）；雌二醇（寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號:B130613）；戊巴比妥鈉；尿素購自于GibcoBRL公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、PMSF、過硫酸胺和考馬斯亮藍染料 G250均為Amesco公司產(chǎn)品；二硫素糖醇（DTT）和碘乙酰胺（IAM）購自于Promega 公司；丙烯酰胺、SDS、N，N，N’，N-四甲基乙烯二胺（TEMED）和溴酚藍購自SIGMA 公司；乙醇、乙酸和甲酸購自北京化工廠；乙腈和甲醇購自 Fisher Scientifc公司；iTRAQ?Reagent-8Plex Multiplex Kit購自于 Biosystem公司；strata-X C18 除鹽柱和SCX 強陽離子交換柱購自于phenomenex公司。

三、實驗儀器及分析軟件

BIC-400 型人工氣候箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BS-1105型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司）；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；島津常規(guī)液相；戴安納升液相；Q-Exactive 質(zhì)譜儀（Thermo fisher）；UMAX Powerlook 2100XL-USB 掃描儀；IKA 振蕩器；Tanon 電泳槽；DYY-7C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；恒溫加熱塊（鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；離心機（eppendorf centrifuge 5417R型）； LX-100 手掌式離心機（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋(長安科學(xué)儀器) ；數(shù)據(jù)采集軟件：Thermofisher Proteome Discoverer 1.3 ；Mascot 軟件版本：2.3.0； IPA 在線生物信息軟件平臺（Ingenuity Systems公司）。

四、實驗方法

（一）實驗動物分組

將田口法正交應(yīng)用于五階恒流快速充電方法中,進行電池充放電實驗,測量充電時間和充電容量的百分比將其作為模糊控制器的輸入量,從而提高充電效率。

取70只雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，自由飲水、進食，12/12 h 晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20±2）℃、濕度40%~60%，并對大鼠生物學(xué)表征進行動態(tài)觀察和記錄，一周后行交配實驗和APO實驗證實具有正常的性功能后，從中隨機挑選出10只為正常對照組（N），余60只為造模組，并開始造模。

（二）異常黏液質(zhì)證與陽痿病證大鼠模型的建立

以“濕寒性環(huán)境+濕寒性飼料”符合干預(yù)方法建立異常黏液質(zhì)證候模型，并從中篩選ED模型后分組為病證組（A1）和病證藥物干預(yù)組（A3），未成ED者分為證候組（B1）和證候藥物干預(yù)組（B3），并設(shè)立正常對照組，經(jīng)維藥伊木薩克片口服干預(yù)2周后取材（其中證候藥物干預(yù)組和病證藥物干預(yù)組用于其他實驗） ，具體方法見文獻[1,2]。

（三）取材

實驗終結(jié)時，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射（50mg/ kg）麻醉，快速從腹主動脈取血，置于4℃環(huán)境30min后，在4℃離心機離心（1000~1400×g）15min獲取血清，分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

（四）低豐度蛋白樣品的制備和血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

各組大鼠分別取10份血清樣本，進行等體積混樣制備N組、B1組和A1組大鼠血清樣品，每組體積為1000μL，利用低豐度蛋白富集試劑盒（多肽配體親和層析柱）特異性吸附并制備血清低豐度蛋白組，測定總蛋白含量。每組樣品取 50μg 蛋白體積，并用胰蛋白酶酶解得到相應(yīng)各組肽段，按照說明書操作及標(biāo)記消化后的各組肽段，對照組和造模組樣品分別加入iTRAQ 113、114和115試劑進行標(biāo)記。標(biāo)記結(jié)束后，用HPLC強陽離子交換柱進行分離分級，收集穿流以及洗脫部分合并，之后予C18 反相色譜除鹽，除鹽后的肽段經(jīng)Q-Exactive 質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。Q-Exactive 質(zhì)譜儀檢測肽段信號，參數(shù)為離子模式為陽離子模式，毛細(xì)管溫度為320℃，檢測方式為正離子。質(zhì)譜掃描完畢，將質(zhì)譜圖輸入到 PD（Proteome discoverer 1.3，thermo）軟件，PD 提取后的譜圖用mascot 進行搜索，PD 軟件根據(jù) mascot 搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析，最終得到經(jīng)鑒定的蛋白數(shù)量及種類。

（五）差異蛋白的IPA 生物信息學(xué)分析

在 iTRAQ標(biāo)記技術(shù)結(jié)合LC-MS-MS基礎(chǔ)上，結(jié)合維醫(yī)理論篩選出異常黏液質(zhì)型陽痿病證組大鼠模型血清差異候選蛋白，通過IPA 在線生物信息學(xué)分析平臺對獲得的差異候選蛋白進行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析（Networks analysis）、生物功能分析（Biofuction analysis）、 典型通路分析（Canonical pathways）和IPA生物標(biāo)志物篩查分析（IPA-biomarker~Filter），并進一步探討其可能的作用網(wǎng)絡(luò)與候選生物標(biāo)志物。

結(jié) 果

一、iTRAQ技術(shù)鑒定血清蛋白結(jié)果

經(jīng)iTRAQ標(biāo)記技術(shù)結(jié)合LC-MS-MS，結(jié)合維醫(yī)理論，篩選出異常黏液質(zhì)型陽痿病證差異候選血清蛋白為血管緊張素原、T-激肽原1、T-激肽原2、心房利鈉肽受體2、β-2-糖蛋白1、黏著斑蛋白、銅轉(zhuǎn)運ATP酶1、血小板-白細(xì)胞C激酶底物、 突觸小泡磷酸酶-2、α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N、α-1-3抑制劑、C反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白-1、蛋白質(zhì)UNC-13同源D等61種蛋白，其中上調(diào)表達蛋白40種，下調(diào)表達蛋白21種。

二、IPA生物信息學(xué)分析結(jié)果

（一）差異蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

結(jié)果顯示，該病證大鼠模型血清中的差異蛋白集中參與的相互作用功能子網(wǎng)絡(luò)主要集中在（1）細(xì)胞裝配和形成、組織發(fā)育、細(xì)胞與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和相互作用；（2）心血管系統(tǒng)發(fā)育和功能、器官形態(tài)、細(xì)胞間信號和互動；（3） 細(xì)胞死亡和生存、DNA復(fù)制和重組與修復(fù)、細(xì)胞形態(tài)；（4）癌癥、血液疾病、免疫疾病等4個功能模塊，見表1。

（二）生物功能分析

1. 蛋白質(zhì)功能注釋：結(jié)果顯示，差異表達蛋白質(zhì)中與血管內(nèi)皮相關(guān)蛋白質(zhì)為血管緊張素原、T-激肽原1、T - 激肽原2、心房利鈉肽受體2、β-2-糖蛋白1和黏著斑蛋白等6 種；與平滑肌活動相關(guān)蛋白質(zhì)為銅轉(zhuǎn)運ATP酶1、β-2-糖蛋白1和心房利鈉肽受體2等 3 種；與脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)為血管緊張素原、 β-2-糖蛋白1、 血小板-白細(xì)胞C激酶底物和突觸小泡磷酸酶-2 等4種，與炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)有T-激肽原1、 α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗蛋白酶、T - 激肽原2、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N、血清鐵傳遞蛋白、α-1-3抑制劑、C反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白-1和蛋白質(zhì)UNC-13同源D等 10種。

2. 生物學(xué)過程分布：結(jié)果顯示，該病證大鼠模型血清中的差異蛋白主要參與了損傷反應(yīng)、急性期和炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)、蛋白質(zhì)復(fù)合物合成以及血液循環(huán)等過程。圖1只列出前l(fā)0位主要涉及的生物學(xué)過程。

3. 分子功能分析：結(jié)果顯示，上述候選蛋白質(zhì)主要發(fā)揮肽酶抑制劑活化、氧氣結(jié)合、運輸、肌動蛋白質(zhì)結(jié)合以及有機酸結(jié)合等功能。圖2只列出前l(fā)0位主要涉及的分子功能。

（三）典型通路分析

結(jié)果顯示，上述差異表達的蛋白主要涉及的信號通路為急性炎癥反應(yīng)通路、LXR/RXR通路、FXR/ RXR通路、上皮黏著連接通路、生殖細(xì)胞-睪丸支持細(xì)胞連接信號通路、肝纖維化/肝星狀細(xì)胞活化通路、14-3-3 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、凝血系統(tǒng)通路及吞噬體成熟通路。圖3只列出主要涉及的前l(fā)0位通路。

表1 異常黏型陽痿病證大鼠模型血清中差異蛋白涉及的4個功能模塊

圖1 血清差異表達蛋白質(zhì)生物學(xué)過程分布

圖2 血清差異表達蛋白質(zhì)分子功能分布

圖3 血清差異表達蛋白質(zhì)信號通路分布

（四）生物標(biāo)志物的篩選分析

1. 蛋白標(biāo)志物篩選：結(jié)果顯示，上述差異表達的候選血清蛋白標(biāo)志物，經(jīng)IPA疾病標(biāo)志物分析模塊分析，其中C反應(yīng)蛋白（CRP）、血管緊張素原（AGT）、T-激肽原1（MAP1）和 β-2-糖蛋白1（β2GP1）屬于ED血清蛋白標(biāo)志物 （表2）。

2. 生物標(biāo)志物的相互作用網(wǎng)絡(luò)：對通過IPA疾病庫獲得的與ED相關(guān)4種蛋白構(gòu)建了相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），結(jié)果顯示，上述4種蛋白質(zhì)存在直接或間接的相互作用關(guān)系，其中IL-6間接的影響了這4個蛋白表達， 4個差異蛋白均呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢。網(wǎng)絡(luò)中的紅色點為實驗數(shù)據(jù)中的上調(diào)差異表達蛋白，實線表示直接信號通路，虛線表示間接信號通路。

表2 異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠血清中ED生物標(biāo)志物的IPA篩選分析

圖4 勃起功能障礙候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物相互作用網(wǎng)絡(luò)

討 論

維吾爾醫(yī)學(xué)（維醫(yī)）作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫中的重要成員，經(jīng)歷史積淀，形成了其獨特的診療體系，對陽痿、早泄和少弱精子癥等生殖類疾病表現(xiàn)出極大的療效優(yōu)勢。前期工作中，本研究團隊在成功建立異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合對應(yīng)藥物干預(yù)開展了其生殖生物學(xué)基礎(chǔ)研究，從神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)（NEI）與陰莖勃起相關(guān)傳導(dǎo)通路方面初步揭示了該病證的科學(xué)內(nèi)涵與對應(yīng)藥物的作用機制。但異常黏液質(zhì)型陽痿作為全身性疾病，遠未能揭開其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，闡明其核心機制，需進一步深入研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)與發(fā)展為該領(lǐng)域的研究提供了新的途徑，使疾病的研究思路和方法從個別或單一基因表達調(diào)控差異研究層次發(fā)生了跳躍，轉(zhuǎn)入更高層次，使我們從整體水平層次上對機體與環(huán)境之間的相互影響開展研究，并做出全面而系統(tǒng)評價成為可能。維醫(yī)辨證分型的起點和核心是維醫(yī)“體液論”，其出發(fā)點是人體內(nèi)在體液動態(tài)變化的外在表現(xiàn)，而維醫(yī)藥學(xué)所推崇的辨證施治也是依據(jù)個體的整體水平上發(fā)生的體液表型差異，這與系統(tǒng)生物學(xué)整體研究思路也不謀而合。

本研究中，本團隊通過同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合LC-MS-MS研究了異常黏液質(zhì)型陽痿病證，并獲得大鼠血清候選差異蛋白61種，其中上調(diào)表達蛋白40種，下調(diào)表達蛋白21種。通過IPA的蛋白質(zhì)功能注釋，發(fā)現(xiàn)其中有6種蛋白質(zhì)與血管內(nèi)皮功能相關(guān)，3種蛋白質(zhì)與平滑肌功能相關(guān)，提示，該病證發(fā)生發(fā)展過程當(dāng)中血管內(nèi)皮功能和平滑肌功能改變發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，更可能是其核心病理機制，這一點與以往的研究報道[3-5]相吻合。同時有10種蛋白質(zhì)與炎癥相關(guān)，其中T-激肽原1，α-1-酸性糖蛋白和C反應(yīng)蛋白均屬于急性時相期蛋白；生物功能分析結(jié)果表明，該病證差異蛋白的生物功能主要集中在損傷反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)等，提示，該病證的發(fā)生發(fā)展中炎癥可能發(fā)揮著重要作用。典型通路分析結(jié)果表明，差異蛋白主要涉及LXR/RXR通路和FXR/ RXR通路，結(jié)合文獻[6,7]研究發(fā)現(xiàn)，上述通路與炎癥和脂質(zhì)代謝、糖代謝密切相關(guān)。結(jié)合我們以往的研究結(jié)果[8-10]，我們認(rèn)為該病證發(fā)生發(fā)展可能與慢性炎癥引發(fā)的NEI紊亂和代謝功能改變有關(guān)，并可進一步影響血管內(nèi)皮功能，但尚需進一步驗證，尤其是需要結(jié)合本研究差異蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果，就其具體機制進行進一步探索。

本研究中，在篩查出的差異蛋白質(zhì)中，經(jīng)IPA進一步篩查，得出CRP、AGT、MAP1和β2GP1 4種蛋白是ED血清標(biāo)志物，其中CRP是體內(nèi)重要的促炎癥細(xì)胞因子，能使內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等一氧化氮（NO）表達及分泌降低，內(nèi)皮素-1（ET-1）表達和分泌增加。另有學(xué)者報道[11,12]，ED患者較高的CRP水平可通過下調(diào) eNOS的表達，促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減弱血管內(nèi)皮損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞再生，影響血管內(nèi)皮功能。AGT在腎素的作用下可以產(chǎn)生血管緊張素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中血管緊張素Ⅱ具有強烈的縮血管的作用，調(diào)節(jié)陰莖勃起功能[13]。有研究報道[14]，血管緊張素Ⅱ主要分布在陰莖海綿體血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)層及平滑肌束中，器質(zhì)性 ED患者的海綿體局部和外周血液中Ang-Ⅱ濃度均顯著增高。激肽原屬于激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS），是生物體內(nèi)重要的炎性調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與心血管、腎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等各組織器官的炎癥過程，分為高分子量（HMW）、低分子量（LMW）、T-激肽原1（MAP1）和T-激肽原2（MAP2）[15]。 激肽原作為作為活性肽和緩激肽的前體，可影響平滑肌收縮，誘導(dǎo)低血壓和血管通透性增加。體外實驗證實[16]，KKS系統(tǒng)的活性成分可以舒張人陰莖海綿體，但其是否存在于生理狀態(tài)下的陰莖海綿體組織中尚未見報道。β2GP1 作為一種生理性蛋白在糖尿病、動脈粥樣硬化及血管新生過程中發(fā)揮著重要作用，其中β2GP1與血小板之間的關(guān)系研究較多，有報道[17]稱，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷使血小板活化后，釋放的炎癥遞質(zhì)及細(xì)胞因子可誘導(dǎo)并促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，進而促使ED發(fā)生，并認(rèn)為血小板及其相關(guān)功能指標(biāo)也作為 ED診療中的一類重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，CRP、AGT、MAP1和β2GP1 4種蛋白作為異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠血清候選標(biāo)志物，均顯著上調(diào)，且在IPA分析中顯示它們是ED血清標(biāo)志物，結(jié)合以往的研究，我們認(rèn)為，其可能直接或間接參與了該病證的發(fā)生發(fā)展過程，并可作為異常黏液質(zhì)型陽痿病證重要的血清標(biāo)志物之一。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)IPA平臺對iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS-MS獲得的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進行進一步挖掘與分析，我們認(rèn)為異常黏液質(zhì)型陽痿病證屬于全身性疾病，炎癥-NEI紊亂和代謝功能改變在其發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，在候選指標(biāo)中，可在將CRP、AGT、MAP1和Β2GP1作為異常黏液質(zhì)型陽痿病證血清標(biāo)志物基礎(chǔ)上，進一步對其它候選蛋白標(biāo)志物進行驗證后，確定其他蛋白標(biāo)志物，并建立相應(yīng)體系，為進一步開展功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究，以揭示該病證的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，并為基于標(biāo)志物基礎(chǔ)上的臨床基礎(chǔ)研究和藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

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（2016-10-08收稿）

Serum proteomics analysis of abnormal phlegmatic rats model with impotence disease using iTRAQ and IPA bioanalysis platform*

Ma Wenjing1, Maowulan Maimaiti2, Zhang Panpan3, Siyiti Amuti3, Liu Fengxia3, Xue Zhiqin3, Jiang Ping4, Alai Bahetihan3, Adilijiang Yiming3**
1. Central Laboratory, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Department of Biology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University; 3. Department of HumanAnatomy, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University; 4. Department of PhysiologyCollege of Basic Medicine, Xinjiang Medical University Corresponding author: Adilijiang Yiming, E-mail: adljym@163.com

Objective To screen the candidate serum biomarkers for abnormal phlegmatic syndrome with impotence disease using iTRAQ and IPA bioanalysis platform, and explore its molecular mechanism. Methods Rats with abnormal phlegmatic syndrome model were established, and abnormal phlegmatic syndrome rats model with impotence were selected and divided into three groups: the control group(N), phlegmatic syndrome model group(B1) and phlegmatic syndrome model group with impotence (A1) (n=10). Serum proteomics of these rats among three groups were comparatively analyzed by iTRAQ labeling combined with LC-MS-MS. Differentially expressed serum proteins were further analyzed by IPA online bioinformatics software,including networks analysis, biofunction Analysis, canonical Pathways and IPA Biomarker~Filter analysis. Results Total of 61 differentially expressed serum proteins were identifed by iTRAQ. IPA bioanalysis showedthat 6 different proteins were associated with vascular endothelial function, 3 proteins of smooth muscle activity,10 proteins associated with infammation. The main biological processes of differential proteins were injury, infammation reaction and defense response. The pathways involved in LXR/RXR activation and FXR/RXR activation. Four candidate biomarkers associated with Erectile Dysfunction disease were found, including C-reactive protein, Angiotensinogen, T-kininogen-1 and β-2-glycoprotein 1. Conclusion Infammation and vascular endothelial function may play a key role in the development of this disease, four proteins can be used as candidate proteins related to abnormal phlegmatic with impotence disease.

Abnormal phlegmatic syndrome; Impotence; IPA@bioinformatics analysis; biological markers

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.12.001

R 698.1

資助：國家自然科學(xué)基金項目（81260581）**

，E-mail: adljym@163.com