安榮韓佩玉徐秋穎丁維俊孔維

成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都 610075)

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痛瀉要方對(duì)腸易激綜合征模型大鼠腸道高敏感性及海馬區(qū)c-Fos表達(dá)的影響*

安榮▲韓佩玉△◇徐秋穎丁維俊孔維◆

成都中醫(yī)藥大學(xué)(成都 610075)

摘要目的：觀察痛瀉要方對(duì)腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)及海馬區(qū)c-Fos表達(dá)的影響，探討c-Fos在IBS發(fā)病中的作用機(jī)制。方法：采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激聯(lián)合高糖高脂飼料、高溫高濕環(huán)境加酒精刺激，建立IBS大鼠模型，應(yīng)用痛瀉要方干預(yù)，雙歧桿菌作為陽性藥物對(duì)照。觀察大鼠一般情況、體重、腸道敏感性變化，連續(xù)治療3周后,采用免疫組化法檢測(cè)海馬區(qū)c-Fos表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，IBS模型組大鼠精神萎靡，體重明顯降低、腸道敏感性升高、海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞率增加(P<0.01)。與模型組比較，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠精神好轉(zhuǎn)、體重增加、腸道敏感性降低，海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞率降低(P<0.05或P<0.01)。兩治療組比較無顯著差異。結(jié)論：c-Fos的表達(dá)與IBS的內(nèi)臟敏感性有一定的聯(lián)系，痛瀉要方可能通過調(diào)節(jié)中樞c-Fos表達(dá)，從而改善腸道高敏感性，治療IBS。

主題詞腸易激綜合征/中醫(yī)藥療法 痛瀉要方/治療應(yīng)用 體重變化 @c-Fos 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome, IBS)是一種持續(xù)或間歇發(fā)作的腹痛、腹脹、排便行為和大便性狀異常，而缺乏胃腸道結(jié)構(gòu)改變和生化異常依據(jù)的慢性腸道功能紊亂性疾病。我國IBS發(fā)病率為5%～12%[1]，歐美地區(qū)據(jù)報(bào)道為10%～20%[2-4]。其發(fā)病原因復(fù)雜，可能與胃腸道動(dòng)力障礙、內(nèi)臟感覺過敏、腦腸軸紊亂、腸道菌群失調(diào)、腸道炎癥和免疫反應(yīng)、精神心理因素、遺傳等多種因素有關(guān)。其中內(nèi)臟感覺過敏作為IBS重要病因和病理生理特征之一，被認(rèn)為是腹部不適感覺的主要機(jī)制，可能是由內(nèi)臟感覺通路異?；蚰X腸軸調(diào)節(jié)紊亂造成的。腦腸肽c-Fos作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物，在IBS的發(fā)病中起著重要作用。中藥復(fù)方痛瀉要方由炒白術(shù)、炒白芍、防風(fēng)、陳皮四味中藥配伍而成，具有補(bǔ)脾柔肝，祛濕止瀉等功效，適用于IBS。本實(shí)驗(yàn)采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激聯(lián)合高糖高脂飼料、高溫高濕環(huán)境加酒精刺激，建立IBS大鼠模型，應(yīng)用痛瀉要方干預(yù)，觀察各組大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能各項(xiàng)指標(biāo)及海馬區(qū)c-Fos表達(dá)情況，初步探討其可能作用機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物8周齡SPF級(jí)SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠40只，體重180～210g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(川)2013-24。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)十二橋校區(qū)中醫(yī)眼科實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房獨(dú)立換氣系統(tǒng)籠具(IVC)，每籠5只，每3d更換墊料，清洗、消毒籠具。室溫22～27℃，濕度50～70%，晝夜節(jié)律控制為12/12h(8:00開燈，20:00關(guān)燈)。

1.2藥物與試劑中藥痛瀉要方免煎顆粒江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，組成如下：炒白術(shù)3g/袋，相當(dāng)飲片10g，批號(hào)1401089；炒白芍1g/袋，相當(dāng)飲片10g，批號(hào)1312078；防風(fēng)1g/袋，相當(dāng)飲片6g，批號(hào)1401089；陳皮1g/袋，相當(dāng)飲片6g，批號(hào)1401089，臨用前將以上四種藥各取1袋混合，以6g∶12mL蒸餾水溶解充分予以灌胃。雙歧桿菌活菌膠囊購于四川大藥房，由麗珠醫(yī)藥生產(chǎn)(麗珠腸樂)，每粒含0.5億活菌，批號(hào)20131135，4℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩ＥR用前每粒以10mL蒸餾水混勻予以灌胃。兔抗大鼠c-Fos多克隆抗體(一抗)，編號(hào)ab53036，abcam公司生產(chǎn)。免疫組化染色試劑盒SP-9001，北京中杉金橋生產(chǎn)。

1.3主要儀器8Fr(3mm)雙腔兒童型末端帶氣囊導(dǎo)尿管，Leica EG 1160包埋機(jī)，Leica RM 2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，Leica HI 1220 烘片機(jī)，OlympusBX51光學(xué)顯微鏡。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1動(dòng)物分組普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照體重隨機(jī)將40只SD大鼠分為正常對(duì)照(N)組、模型對(duì)照(M)組、痛瀉要方(T)組、雙歧桿菌(B)組，每組10只。

2.2IBS模型建立IBC正常對(duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組完成兩方面造模： 脾胃濕熱泄瀉造模：以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。造模第8天將大鼠每天放入自制造模箱高溫高濕環(huán)境(溫度32±2℃，相對(duì)濕度90±5%)2h。從第15天開始灌胃紅星二鍋頭(酒精度56%)，劑量7mL/kg，1次/d，共7d。 慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激造模：隨機(jī)給予①禁食24h；②禁水24h；③45℃環(huán)境5min；④夾尾1min：用止血鉗夾住距離尾尖1cm處，力度使動(dòng)物發(fā)出哀叫聲即可，持續(xù)1 min；⑤4℃冰水游泳3min；⑥12h～12h晝夜顛倒；⑦水平振蕩(150次/min)45 min。每日隨機(jī)給予大鼠以上刺激的1種處理，每7d為1個(gè)周期，且任何連續(xù)2d的刺激均不相同，使大鼠不能預(yù)見發(fā)生何種刺激，共持續(xù)3周。

2.3給藥及方法T組給予痛瀉要方顆粒混懸液4mL/kg·d灌胃；B組給予雙歧桿菌混懸液5×106CFU/mL以4mL/kg·d灌胃；N組、M組均給予生理鹽水4mL/kg·d灌胃。連續(xù)3周。

2.4指標(biāo)測(cè)定2.4.1體重測(cè)定：每周測(cè)定體重1次。

2.4.2痛閾測(cè)定：分別于造模前、造模后、干預(yù)后測(cè)定，大鼠禁食不禁水12 h，乙醚麻醉后，將8Fr(3mL)雙腔兒童型末端帶氣囊導(dǎo)尿管外涂石蠟油后插入肛門，使氣囊近端距肛門1 cm。將肛門外導(dǎo)尿管用膠帶從鼠尾近端開始固定，每隔2 cm處同樣方法固定，導(dǎo)管與注射器相連。將大鼠固定于透明塑料盒中，使其不能前后移動(dòng)、翻轉(zhuǎn)，待大鼠蘇醒適應(yīng)環(huán)境后, 注射器慢慢向球囊內(nèi)注入常溫水?dāng)U張，觀察腹部收縮反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)，記錄引起大鼠腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面時(shí)的最小注水量，重復(fù)擴(kuò)張 3 次, 每次間隔 5 min, 取3 次擴(kuò)張測(cè)得的最小注水量的均值代表痛閾，評(píng)價(jià)大鼠對(duì)直腸內(nèi)擴(kuò)張刺激的敏感性。

2.4.3免疫組化法測(cè)定海馬區(qū)c-Fos表達(dá)：以10%水合氯醛30mL/kg行腹腔注射麻醉，開胸分別以生理鹽水、10%的甲醛經(jīng)心臟灌洗后，迅速取出大腦，放入10%的甲醛中固定。取視交叉后4mm處至小腦前的腦組織常規(guī)石蠟包埋，4μm厚度切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的玻片備用。采用免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶(S-P)法測(cè)定大鼠大腦海馬區(qū)c-Fos表達(dá)。光鏡下以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕色、棕褐色顆粒為c-Fos陽性表達(dá)。觀察c-Fos免疫組化染色細(xì)胞陽性率，在200倍視野下選擇海馬同一區(qū)域記錄染色陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1一般情況整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，無大鼠死亡現(xiàn)象。正常對(duì)照組大鼠反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)良好，飲食、大便正常，毛發(fā)順滑有光澤，造模后各組大鼠精神萎靡，易激惹，弓背，倦怠蜷臥，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，食欲減低，出現(xiàn)不同程度稀便，體重增長緩慢或略有下降，毛發(fā)發(fā)黃、污穢、缺少光澤，肛周夾有粘液或體毛被稀便沾染。經(jīng)藥物治療后各組大鼠上述表現(xiàn)均較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。

3.2痛瀉要方對(duì)IBS大鼠體重的影響見表1。

大鼠實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠體重呈穩(wěn)定的上升趨勢(shì)，而造模各組大鼠體重增長緩慢。與正常對(duì)照組比較，自造模第2周起，造模各組大鼠體重明顯開始低于正常組(P<0.01)，說明造模造成大鼠食欲減低，腹瀉出現(xiàn)導(dǎo)致體重增長緩慢。治療后，用藥組大鼠體重增長高于模型對(duì)照組，與模型對(duì)照組比較，自用藥2周起，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠體重增長明顯高于模型對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，說明痛瀉要方、雙歧桿菌治療IBS大鼠腹瀉效果明顯。痛瀉要方組與雙歧桿菌組比較，大鼠體重增長沒有明顯差異(P>0.05),說明兩者治療大鼠腹瀉效果相當(dāng)。

表1　痛瀉要方對(duì)IBS大鼠體重的影響

注：與正常對(duì)照(N)組比較， ▲P<0.01；與模型對(duì)照組(T)比較，◇P<0.05，◆P<0.01

3.3痛瀉要方對(duì)IBS大鼠腸道痛閾的影響見表2。

造模后各組大鼠引起疼痛的直腸球囊最小注水量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)，說明造模后大鼠腸道敏感性增高，痛閾降低。治療3周后，模型對(duì)照組、痛瀉要方組大鼠直腸球囊最小注水量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠直腸球囊最小注水量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，說明其治療有助于降低腸道敏感性，痛閾升高；與雙歧桿菌組比較，痛瀉要方組大鼠直腸球囊最小注水量無明顯變化(P>0.05),說明兩者降低腸道敏感性效果相當(dāng)。

表2　痛瀉要方對(duì)IBS大鼠腸道痛

注：與正常對(duì)照(N)組比較，△P<0.05, ▲P<0.01；與模型對(duì)照組(T)比較，◇P<0.05，◆P<0.01

3.4痛瀉要方對(duì)IBS大鼠海馬區(qū)c-Fos的影響見表3、圖1。治療3周后，與正常組對(duì)照比較，模型對(duì)照組、痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞率均明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞率均明顯降低(P<0.01)，說明兩者均有一定降低海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞率的作用；兩治療組比較，大鼠海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞率無明顯變化(P>0.05),說明兩者降低海馬區(qū)c-Fos表達(dá)的作用相當(dāng)。

表3　痛瀉要方對(duì)IBS大鼠海馬區(qū)

注：與正常對(duì)照(N)組比較，?P<0.01；與模型對(duì)照組(T)比較，▲P<0.01

圖1　各組大鼠海馬區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞表達(dá)情況

4討論中醫(yī)學(xué)將IBS歸為“腹痛”、“泄瀉”、“便秘”、“郁證”等范疇；認(rèn)為本病由飲食不節(jié)、感受外邪、內(nèi)傷七情、勞役稟賦等原因，導(dǎo)致肝脾失調(diào)，脾運(yùn)失常，肝氣郁結(jié)，進(jìn)而橫逆乘脾，致脾胃升降失調(diào)，氣機(jī)逆亂，出現(xiàn)腹痛、泄瀉等癥狀[5]。IBS主要證型有脾虛濕阻、肝郁脾虛、脾腎陽虛、脾胃濕熱、肝郁氣滯及腸道燥熱證[5-7]。肝郁脾虛是IBS核心病機(jī)，肝失疏泄是IBS 重要成因，脾胃升降失調(diào)是IBS發(fā)生的直接原因。痛瀉要方由白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)組成，方中白術(shù)苦溫，補(bǔ)脾燥濕，為君藥；白芍酸寒，柔肝緩急止痛，與白術(shù)配伍，為臣藥；陳皮辛苦而溫，理氣燥濕，醒脾和胃，為佐藥；防風(fēng)燥濕以助止瀉，為脾經(jīng)引經(jīng)藥，故為佐使藥。全方抓住IBS核心病機(jī)，適合于腹瀉型IBS,臨床療效良好。

西醫(yī)認(rèn)為IBS病因復(fù)雜，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦腸軸調(diào)控紊亂是IBS的重要病理基礎(chǔ)。而腦腸肽將腸神經(jīng)和中樞神經(jīng)聯(lián)系起來，調(diào)控腸道運(yùn)動(dòng)、感覺和內(nèi)分泌功能，研究較多的腦腸肽包括5-羥色胺(5-HT)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)、P物質(zhì)(SP)、c-Fos等，其中c-Fos是c-fos基因表達(dá)核蛋白，c-fos是即刻早期基因(Immediate early genes,IEGs)的一種表達(dá)蛋白，IEGs是在細(xì)胞受到刺激時(shí)最先表達(dá)的一組基因，c-fos的功能是通過c-Fos實(shí)現(xiàn)的，近年來作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物用于神經(jīng)元通路的研究。研究表明，c-fos基因可被多種刺激如缺氧、疼痛刺激、機(jī)械刺激、慢性心理刺激、光線刺激等誘導(dǎo)在中樞海馬、大腦皮質(zhì)、紋狀體快速表達(dá)，其中以海馬表達(dá)最為密集[8-12]，說明c-fos是調(diào)控心理應(yīng)激反應(yīng)和抗應(yīng)激損傷的作用靶點(diǎn)之一。IBS因?yàn)閮?nèi)臟高敏感性引起的腹痛、腹瀉、腹脹等刺激，使中樞c-fos基因處于高表達(dá)狀態(tài)。研究表明[13]c-fos的表達(dá)與IBS的內(nèi)臟敏感性和腸道運(yùn)動(dòng)有一定的聯(lián)系，腸神經(jīng)叢初級(jí)感覺神經(jīng)元的激活是IBS內(nèi)臟高敏感的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合造模方法建立脾胃濕熱泄瀉型IBS大鼠模型，免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)c-Fos的陽性表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬區(qū)c-Fos的陽性細(xì)胞表達(dá)率較正常組顯著增高，說明脾胃濕熱泄瀉型IBS模型大鼠體內(nèi)存在c-Fos水平升高的病理狀態(tài)，經(jīng)治療后，痛瀉要方組、雙歧桿菌組大鼠海馬區(qū)c-Fos較模型組顯著降低。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組大鼠腸道敏感性的變化，模型組較正常組痛閾明顯降低，腸道敏感性升高，經(jīng)治療后，痛瀉要方組、雙歧桿菌組較模型組痛閾明顯升高，腸道敏感性降低。由此我們推測(cè)：應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)中樞c-fos表達(dá)量增加，產(chǎn)生的c-Fos升高可能使大鼠對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)能力增強(qiáng)，通過腦-腸軸傳遞，引起腸道敏感性增高、胃腸運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)，從而產(chǎn)生腹痛、腹瀉、腹脹等腸道癥狀，痛瀉要方可能通過降低中樞c-fos基因的表達(dá)從而產(chǎn)生治療腹瀉型IBS的作用。

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(收稿2016-01-09；修回2016-02-13)

【中圖分類號(hào)】R259

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.046

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81303087)

▲陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

◇西南民族大學(xué)(成都 610041)

◆陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院(咸陽712000)

△通訊作者

·實(shí)驗(yàn)研究·