任琳琳，柴　琳

(皖南醫(yī)學(xué)院　1.病理生理學(xué)教研室；2.口腔醫(yī)學(xué)院，安徽　蕪湖　241002)

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AAVC-Ⅰ對人口腔鱗癌Tca8113細胞GRP78和Caspase-4基因表達的影響

任琳琳1，柴琳2

(皖南醫(yī)學(xué)院1.病理生理學(xué)教研室；2.口腔醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：研究不同濃度的AAVC-Ⅰ對人口腔鱗癌Tca8113細胞GRP78、Caspase-4基因表達的影響。方法:設(shè)置正常對照組和AAVC-Ⅰ實驗組，Trizol試劑提取各組總RNA，運用RT-PCR法擴增內(nèi)參基因β-actin及目的基因GRP78、Caspase-4片段，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并采用 QuantityOne軟件測定目的條帶灰度值。結(jié)果：正常對照組、實驗組均擴增出GRP78、Caspase-4目的條帶，且隨AAVC-Ⅰ濃度增大GRP78、Caspase-4表達增加。結(jié)論：高濃度AAVC-Ⅰ可上調(diào)GRP78、Caspase-4基因的表達，因此AAVC-Ⅰ可能誘導(dǎo)人口腔鱗癌Tca8113細胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

【關(guān)鍵詞】AAVC-Ⅰ;GRP78；Caspase-4；Tca8113；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.01.004

蛇毒是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，含有多種毒素和酶類，具有很大的潛在藥用價值，已有大量研究證實，蛇毒提取成分在凝血、抗血栓、止痛及抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用,其中抗腫瘤作用已成為廣大學(xué)者研究的焦點。尖吻蝮蛇毒抑瘤組分 1(anti-tumor component-Ⅰ from Agkistrodon acutus venom，AAVC-Ⅰ)是本校蛇毒研究所利用蛋白分離純化技術(shù)從皖南尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性成分，且已證實其具有很好的抗凝血作用[2-3]，而有關(guān)其抗腫瘤的作用國內(nèi)外報道較少。實驗室前期研究表明AAVC-Ⅰ對小鼠肺癌LLC細胞、A549和K562具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用[4-6]。本實驗以Tca8113細胞為研究對象，進一步探討AAVC-Ⅰ的抗腫瘤作用，為開發(fā)高效抗腫瘤藥物更好服務(wù)臨床提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1主要試劑與儀器AAVC-Ⅰ凍干粉由本校蛇毒研究所提供。PBS緩沖液、RPMI1640液體培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司),無支原體胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素-鏈霉素溶液、胰酶消化液(碧云天生物技術(shù)公司)，GRP78、Caspase-4、CHOP引物合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)，RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)，擴增試劑盒(Thermo公司)。細胞培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS IX51)，超凈工作臺(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，DYY-10C電泳儀、水平電泳槽(北京六一儀器廠)，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，S1000 ThermalCyclerPCR儀(美國BIO-RAD公司)，NANO DROP2000分光光度計(Thermo公司)，SCILOGEX D1008掌上離心機(美國SCILOGEX 公司)。

1.2細胞培養(yǎng)人口腔鱗癌細胞Tca8113來自課題組凍存保留，培養(yǎng)液配制：RPMI1640液體培養(yǎng)基加10%胎牛血清加1%青霉素-鏈霉素溶液，將Tca8113接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長至80%左右，胰蛋白酶消化后進行分瓶傳代。

1.3倒置顯微鏡觀察不同濃度AAVC-Ⅰ干預(yù)后細胞形態(tài)的變化。

1.4RT-PCR檢測GRP78、Caspase-4基因片段表達Trizlo試劑提取總RNA，NANO DROP2000分光光度計測定RNA濃度。12 μL反轉(zhuǎn)錄體系：TemplateRNA 5 μL，Oligo(dt)181 μL，H2O(nuclease-free)6 μL，離心混勻，70℃、5 min，取出迅速置于冰盒內(nèi)，3 min后加入5×Reaction Buffer 4 μL、RiboLock RNase inhibitor(20U/μL)1 μL、10 mmol/L dNTPMix 2 μL、RevertAid MuLVRT(200U/μL)1 μL，離心混勻，42℃60 min，95℃5 min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。β-actin、GRP78、Caspase-4引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列、擴增產(chǎn)物長度、退火溫度見表1。

表1引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度

基因引物序列產(chǎn)物堿基數(shù)/bpTm/℃β-actinF:5'-AGCGAGCATC-CCCCAAAGTT-3'28558R:5'-GGGCACGAAGGCTCAT-CATT-3'GRP78F:5'-CTATGTCGCCTTCACTCC-3'13250R:5'-ACAGACGGGTCATTCCAC-3'Caspase-4F:5'-TCACAGGGATGAAGGAGC-3'44951R:5'-TGGCGTTGAAGAGCAGAA-3'

50 μL PCR反應(yīng)體系：PCR Master Mix(2×)25 μL、Forward primer 5 μL(1 μmol/L)、Reverse primer 5 μL(1 μmol/L)、Template DNA 1 μL(1 μg/μL)、H2O(nuclease-free)14 μL。

2結(jié)果

2.1AAVC-Ⅰ作用后Tca8113細胞形態(tài)變化正常Tca8113細胞呈不規(guī)則的多邊形或梭形，胞質(zhì)均勻，細胞間分界明顯，貼壁生長。AAVC-Ⅰ作用12 h后隨濃度增加(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)，Tca8113細胞體積變小，細胞間隙增大，半貼壁細胞或懸浮細胞增加，出現(xiàn)凋亡細胞樣改變,細胞皺縮變圓，胞質(zhì)密度增加，細胞膜破壞，細胞融合抱團界限不清(如圖1所示)。

A：正常對照組(×200)；B:AAVC-Ⅰ 3.125 μg/mL組(×200)；C:AAVC-Ⅰ 6.25 μg/mL組(×200)；D:AAVC-Ⅰ 12.5 μg/mL組(×200)。

圖1不同濃度AAVC-Ⅰ作用下細胞形態(tài)改變

2.2瓊脂糖凝膠電泳配制2%瓊脂糖凝膠，β-actin、GRP78、Caspase-4 PCR擴增產(chǎn)物上樣，每孔5 μL樣品+BeyoRed DNA上樣緩沖液(6×)1 μL，選擇110 V，50 min進行電泳，運用ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)拍照，正常對照組、實驗組均擴增出β-actin、GRP78、Caspase-4目的條帶，其中β-actin穩(wěn)定表達，GRP78、Caspase-4隨AAVC-Ⅰ(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)濃度增大表達增加。如圖2、3示。

2.3數(shù)據(jù)分析采用 QuantityOne軟件分別檢測正常對照組和AAVC-Ⅰ實驗組目的條帶灰度值，各組GRP78與內(nèi)參基因的比值如表2示，Caspase-4與內(nèi)參基因的比值如表3示，AAVC-Ⅰ實驗組隨濃度的增大，GRP78、Caspase-4基因表達水平較正常組顯著上調(diào)，P<0.05代表其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

M:DNA Ladder；1,2,3,4泳道各AAVC-Ⅰ(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)實驗組β-actin及GRP78、Caspase-4目的條帶。

圖2不同濃度 AAVC-Ⅰ作用下GRP78基因表達

M:DNA Ladder；1,2,3,4泳道各AAVC-Ⅰ(0、3.125、6.25、12.5 μg/mL)實驗組β-actin及GRP78、Caspase-4目的條帶。

圖3不同濃度 AAVC-Ⅰ作用下Caspase-4基因表達

組別AAVC-Ⅰ/(μg/mL)GRP78/β-actin對照組00.3598±0.02655實驗組3.1250.6127±0.066506.250.8228±0.0515612.50.8969±0.07941F值49.486P值<0.01

組別AAVC-Ⅰ/(μg/mL)Caspase-4/β-actin對照組00.0545±0.00134實驗組3.1250.2493±0.006206.250.7081±0.0148012.50.8058±0.01891F值2527.950P值<0.01

3討論

口腔鱗癌作為頭頸部常見的腫瘤性疾病之一,目前主要采用手術(shù)為主的綜合治療[7-8]，預(yù)后較差，且嚴重影響人們的面容，給患者帶來身心上的傷害，亟待尋求一種有效的治療藥物。文獻報道蛇毒提取物不但具有止痛、抗凝等作用，還可通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，起到抗腫瘤作用。李鳳君等[10]研究表明眼鏡蛇心臟毒素(CTX)對肺癌A549細胞具有增殖抑制作用，可促進線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放，降低線粒體膜電位,激活Procaspase-9和 Procaspase-3通過線粒體途徑誘導(dǎo) A549細胞凋亡。同時有研究AAVC-Ⅰ顯示從尖吻蝮蛇毒中提取的細胞毒素ACTX-6，能激活Fas通路使JNK表達上調(diào)，進而級聯(lián)激活caspase-3，誘導(dǎo)A549細胞凋亡[11]。因此，研究蛇毒抗腫瘤機制，開發(fā)新的抗腫瘤藥物成為必然趨勢。

本實驗利用RT-PCR法檢測AAVC-Ⅰ作用后Tca8113細胞GRP78、Caspase-4基因表達情況，發(fā)現(xiàn)隨AAVC-Ⅰ濃度增大，GRP78、Caspase-4基因表達呈上升趨勢，提示AAVC-Ⅰ可能誘導(dǎo)人口腔鱗癌Tca8113細胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。死亡受體途徑和線粒體途徑是誘導(dǎo)細胞凋亡的主要途徑，也是研究較多的途徑，近些年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為一條新的途徑也可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。缺氧、毒物、理化因素等誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生，Caspase-4、GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標志分子，其中GRP78位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，負責(zé)蛋白質(zhì)的折疊及轉(zhuǎn)運，正常情況下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動蛋白PERK、AIF6、IRE1結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時GRP78與三者分離表達增加，并結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊及未折疊蛋白將其轉(zhuǎn)運出去[12-13]，而游離之后的PERK、AIF6、IRE1轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚苑肿樱蓡酉掠渭毎蛲鱿嚓P(guān)信號分子如：TRAF2、JNK、ASKT等來誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase-4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時被活化的IRE1激活，進而級聯(lián)激活下游caspase家族信號分子，誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)。

本實驗將不同濃度的AAVC-Ⅰ處理Tca8113細胞，發(fā)現(xiàn)Caspase-4、GRP78隨著AAVC-Ⅰ濃度增大其表達逐漸增加，其中3.125 μg/mL、6.25 μg/mL兩組差值較6.25 μg/mL、12.5 μg/mL兩組差值大，考慮AAVC-Ⅰ誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有一定的濃度范圍，CHOP通路、JNK-ASKT、Caspase-4/Caspase-12通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)凋亡的主要通路，AAVC-Ⅰ具體通過哪一條通路誘導(dǎo)Tca8113細胞凋亡還需進一步研究。

【參考文獻】

[1] 胡建國.尖吻蝮蛇毒藥理作用的研究進展.中醫(yī)學(xué)報，2013，28(1):74-75.

[2] 孔巖，李曙，張根葆，等． 蝮蛇蛇毒 PCA 對實驗性心肌梗死大鼠血凝狀態(tài)的影響.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009,28(5):316-318,391.

[3] 張根葆，張毅，孔巖,等.五步蛇毒蛋白 C 激活劑的純化與活性分析[J].蛇志，2008,20( 4):249-251．

[4] 周兵，張根葆，段婷,等.尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I對小鼠肺癌 LLC 細胞增殖的抑制作用.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012,31( 2):87-88,91.

[5] 徐平，張根葆，王斐,等.尖吻蝮蛇毒抑瘤組分I對人肺癌A549細胞增殖抑制作用.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014,19(5):493-496.

[6] 鄭汝琦，張根葆，黃璐,等.尖吻蝮蛇蛇毒抑瘤組分 1 誘導(dǎo)白血病 K562細胞凋亡的線粒體機制.中國實驗血液學(xué)雜志，2013,21( 3):591-595.

[7] 徐冬貴.口腔頜面部惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移的研究進展.口腔醫(yī)學(xué)研究，2012,28(4):385-387,390.

[8] ANNERTZ K,ANDERSON H,BIORKLUND A,et al.Incidence and survival of squamous cell carcinoma of the tongue in Scandinavia,with special reference to young adults.Int J Cancer,2002,101(1):95-99.

[9]胡建國.尖吻蝮蛇毒研究進展.蛇志,2012,24(1):56-57.

[10] 李鳳君，袁進,韓麗萍，等.蛇毒心臟毒素誘導(dǎo)肺癌A549細胞的凋亡機制研究.中國藥房，2014,25(7):583-586.

[11] LAURICELLA M,EMANUELLE S,DANNEO A,et al.JNK and AP-1 mediate apoptosis induced by bortezomib in HepG2 cells via FasL/caspase-8 and mitochondria dependent Pathways.Apoptosis,2006,11(4):607-625.

[12] KANEKO M.Molecular pharmacological studies on the protection Mechanism against endoplasmic reticulum stress-inducedneurode-generative disease.Yakugaku Zasshi，2012,132(12):1437-1442．

[13] CHEN X,LI M,CHEN D,et al.Autophagy induced by calcium phos-phate precipitates involves endoplasmic reticulum membranes inau-tophagosome biogenesis.PLoS One，2012,7(12):e52347．

Effects of AAVC-Ⅰ on GRP78 and Caspase-4 gene expression in human oral squamous cell carcinoma Tca8113

REN Linlin，CHAI Lin

Department of Pathophysiology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To observe the effects anti-tumor component-Ⅰ from Agkistrodon acutus venom(AAVC-Ⅰ)in diverse dosage on the expression GRP78 and Caspase-4 gene in human oral squamous carcinoma Tca8113 cell lines.Methods:The experiment was performed in normal control group and AAVC-Ⅰ group.Trizol reagent was used to extract total RNA in each group,and RT-PCR was performed to amplify the internal control β-actin gene and fragments of GRP78 and Caspase-4.ChemiDoc XRS gel imaging system was used to observe electrophoresis presentation,and QuantityOne software to measure the gray value in the target band.Results:Both GRP78 and Caspase-4 were amplified,and the expression of these two genes was up-regulated with increased dose of AAVC-Ⅰ.Conclusion:High dose of AAVC-Ⅰ can increase the expression of GRP78 and Caspase-4 genes,suggesting that AAVC-Ⅰ may induce endoplasmic reticulum stress in the oral squamous carcinoma Tca8113 cell lines.

【Keywords】AAVC-Ⅰ;GRP78;Caspase-4;Tca8113;endoplasmic reticulum stress

文章編號：·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·1002-0217(2016)01-0012-04

基金項目：皖南醫(yī)學(xué)院重點科研培育基金項目(WK2015Z08)

收稿日期：2015-08-11

作者簡介：任琳琳( 1985-),女,2013級碩士研究生，(電話)18375348220,(電子信箱)747104463 @qq.com；

【文獻標識碼】【中圖號】R 739.8A

柴琳,女,副教授,碩士生導(dǎo)師,(電子信箱)869319562@qq.com，通訊作者.