張嚴(yán)高　余　磊　王建莉　朱閩湘　尹戴佳佳

13093795532@163.com

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地塞米松對(duì)異丙腎上腺素所致小鼠急性心肌損傷及脾臟T細(xì)胞亞群的影響

張嚴(yán)高1余磊2王建莉2朱閩湘3,*尹戴佳佳1

13093795532@163.com

【摘要】目的：觀察地塞米松(DEX)對(duì)異丙腎上腺素(ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：16只昆明種小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(CON組)、ISO組、DEX預(yù)處理組(DEX+ISO組)、DEX后處理組(ISO+DEX組)，每組各4例。ISO組腹腔注射ISO(5mg/kg)，1次/天，連續(xù)3天；DEX+ISO組于ISO注射前30min腹腔注射DEX(1.25mg/kg)，連續(xù)3天；ISO+DEX組于實(shí)驗(yàn)第2天和第3天腹腔注射ISO后30min，再腹腔注射DEX(1.25mg/kg)；CON組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)3天。實(shí)驗(yàn)第4天，各組小鼠心臟采血檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)；摘取心臟進(jìn)行HE染色，觀察各組心肌組織形態(tài)學(xué)改變；摘取脾臟，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾組織勻漿T細(xì)胞亞群分布。結(jié)果：(1)與CON組比較，ISO組AST、LDH、CK均顯著升高(P<0．01)；心肌組織損害明顯加重(P<0．01)；脾組織CD8+、CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)上升(P<0．05，P<0.01)。(2)與ISO組比較，DEX+ISO組AST、CK、LDH、CK-MB均下降(P<0．05或P<0.01)；心肌組織損害明顯改善(P<0．01)；脾組織CD4+、 CD8+T細(xì)胞表達(dá)顯著下降(P<0．01)，CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)顯著上升(P<0．01)。(3)與ISO組比較，ISO+DEX組CD8+T細(xì)胞表達(dá)下降(P<0．05)，其余均無(wú)明顯變化(P>0．05)。結(jié)論：DEX預(yù)處理可以明顯改善ISO致小鼠急性心肌缺血損傷，其作用機(jī)制可能與DEX介導(dǎo)的T細(xì)胞亞群免疫應(yīng)答功能改變有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】地塞米松;異丙腎上腺素;心肌損傷;CD4+;CD8+;CD69+；小鼠

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及主要試劑和儀器

昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量20-22g，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)2007000580817，許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002]。ISO注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)131003);DEX注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)1408231)。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 檢測(cè)試劑盒(北京執(zhí)誠(chéng)公司, 批號(hào)ZCAPRN012)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)3102511)；肌酸激酶(CK)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)403281A)；肌酸激酶同功酶(CK-MB)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)404213D)均為北京利德曼公司產(chǎn)品。全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司,7180型)。流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinso公司)；Anti-CD4 FITC antibody(美國(guó)Ebioscience公司，克隆號(hào)RM4-4，批號(hào)E00087-1632)；Anti-CD8a APC antibody(美國(guó)Ebioscience公司，克隆號(hào)53-6.7；批號(hào)B177121)；Anti-CD69 PE antibody(美國(guó)Ebioscience公司，克隆號(hào)H1.2F3， 批號(hào)B177121)。

1.2動(dòng)物分組處理

將16只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON組)、ISO模型組、DEX預(yù)處理組(DEX+ISO組)、DEX后處理組(ISO+DEX組)，各組均4只。ISO組先行腹腔注射生理鹽水(1.25ml/kg)30min后腹腔注射ISO(5mg/kg)，1次/天，連續(xù)3天；DEX+ISO組將生理鹽水改為DEX 1.25mg/kg腹腔注射，余同ISO組，連續(xù)3天；ISO+DEX組在實(shí)驗(yàn)第2天和第3天ISO注射30min后再腹腔注射DEX 1.25mg/kg；CON組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)3天。

1.3檢測(cè)指標(biāo)和方法

實(shí)驗(yàn)第4天，各組小鼠用10g/L戊巴比妥鈉(50g/kg)腹腔注射麻醉，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行心臟取血(2ml)后斷頭處死小鼠，迅速摘取心臟和脾臟。分別測(cè)定血清心肌酶學(xué)指標(biāo)AST、LDH、CK、CK-MB水平，觀察心臟組織形態(tài)學(xué)和心肌損傷程度，分析脾組織中T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、 CD69+分布。

1.3.1心肌酶學(xué)指標(biāo)血清水平測(cè)定:全血以3 500 rpm離心15min，分離血清，轉(zhuǎn)置于-20℃低溫冰箱批檢。采用臨床生化常規(guī)方法測(cè)定AST、LDH、CK及CK-MB。

1.3.2心臟組織形態(tài)學(xué)觀察和心肌損傷程度分級(jí):離體心臟以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、間斷連續(xù)切片(厚約5μm)，HE染色，光鏡下觀察各組小鼠心肌組織學(xué)變化。心肌病理?yè)p傷程度參照Ro-na等的方法[4]進(jìn)行分級(jí)，0級(jí)：心肌細(xì)胞排列緊密，橫紋清晰，心肌纖維染色均勻，核居中，間質(zhì)未見(jiàn)血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙無(wú)水腫，無(wú)出血壞死，心外膜、心內(nèi)膜無(wú)異常，計(jì)0分；I級(jí)：心肌細(xì)胞排列稀疏，間質(zhì)血管擴(kuò)張及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌漿分布不均，心肌間質(zhì)水腫，無(wú)出血，可見(jiàn)心肌散在的點(diǎn)狀壞死，主要為凝固性壞死灶，局限在心內(nèi)膜下，計(jì)2分；II級(jí)：部分心肌壞死灶呈片狀分布，灶間無(wú)連接，病變累及心壁全層，間質(zhì)可見(jiàn)血管擴(kuò)張及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有灶性出血，心肌間質(zhì)有炎性出血及心肌間質(zhì)水腫，計(jì)4分；III級(jí)：心肌廣泛性大片壞死，灶間相互連接累及心壁全層，有明顯間質(zhì)血管擴(kuò)張、水腫、出血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)6分。每只小鼠隨機(jī)選取3張切片，計(jì)算得分均值為該只小鼠所得分值。

1.3.3脾臟組織中T細(xì)胞亞群分析：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取離體脾臟剝除表面結(jié)締組織被膜后，在200目不銹鋼網(wǎng)中輕輕研磨，PBS液洗滌2次后加Tris-NH4Cl液裂解紅細(xì)胞，再洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/100μl。取上述各組單個(gè)核細(xì)胞懸液100μl加入CD4、CD8、CD69熒光抗體，常規(guī)設(shè)置平行空白對(duì)照，4℃避光孵育30min,PBS洗三遍后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的T細(xì)胞亞群(殺傷性T細(xì)胞即CD4+T、 抑制性T細(xì)胞即CD8+T、激活的殺傷性T細(xì)胞即CD4+CD69+T、激活的抑制性T細(xì)胞即CD8+CD69+T)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組心肌酶學(xué)指標(biāo)比較

單因素方差分析顯示各組AST、LDH、CK、CK-MB水平組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。與CON組比較，ISO組AST、LDH、CK均明顯升高(P<0．01)，CK-MB無(wú)明顯改變(P>0．05)；與ISO組比較， 而DEX+ISO組AST、LDH、CK、CK-MB均明顯下降(P<0．05或P<0.01)，ISO+DEX組AST、LDH、CK、CK-MB水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。見(jiàn)表1。

表1　各組血清AST、LDH、CK、CK-MB水平比較均=4)

注：與CON組比較,1)P<0．01；與ISO組比較,2)P<0．05，3)P<0．01

2.2各組心肌組織病理學(xué)改變

HE染色顯示，CON組心肌細(xì)胞排列整齊、致密，胞質(zhì)著色均勻，胞核清晰，間質(zhì)細(xì)胞無(wú)增生，未見(jiàn)炎性滲出、無(wú)水腫(圖1A)。ISO組心肌細(xì)胞體積增大呈圓形或類圓形，排列紊亂，細(xì)胞核固縮深染，血管和心肌細(xì)胞之間可見(jiàn)纖維增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，少量紅細(xì)胞外滲，多處見(jiàn)局灶性壞死(肌溶解、核消失或不著色)(圖1B)。ISO+DEX組肌纖維間充血水腫明顯，可見(jiàn)少許正常肌纖維；多處見(jiàn)肌溶解、核消失或不著色的局灶性壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯(圖1C)。DEX+ISO組心肌損害較ISO組明顯減輕，可見(jiàn)殘存正常肌纖維明顯增多(核圓形、有核仁，胞漿深紅色)，局灶性壞死明顯減少呈散在點(diǎn)狀，肌纖維排列紊亂改善，血管和心肌細(xì)胞之間未見(jiàn)纖維增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。心肌損傷程度評(píng)分定量分析顯示，四組總分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.67,P<0．01)。 ISO組(4.00±0.00)顯著高于CON組(0)(t=12.49,P<0．01)，DEX+ISO組(2.00±0.00)顯著低于ISO組和ISO+DEX組(3.50±0.00)(t=6.24、6.10，P<0．01)，ISO+DEX組與ISO組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.56,P>0．05)。

2.3各組脾臟組織T細(xì)胞亞群分布比較

各組脾臟的CD4+、CD8+、 CD4+CD69+、 CD8+CD69+T細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3、 圖4。方差分析顯示，四組CD4+、CD8+、 CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01),CD8+CD69+T細(xì)胞表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。ISO組CD8+、CD4+CD69+T細(xì)胞較CON組表達(dá)上升(P<0．05，P<0.01)，CD4+、CD8+CD69+T細(xì)胞表達(dá)與CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ISO組比較，DEX+ISO組CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)明顯降低(P<0．01)，CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)明顯上升(P<0．01)。ISO+DEX組CD8+T細(xì)胞較ISO組有所下降(P<0．05)，CD4+、CD4+CD69+、CD8+CD69+T細(xì)胞表達(dá)與ISO組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。見(jiàn)表2。

圖2　各組脾臟CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù)，n=4)

圖3　各組脾臟CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù)，n=4)

圖4　各組脾臟CD8+CD69+T細(xì)胞表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù)，n=4)

表2　各組脾臟T細(xì)胞CD4+、CD8+、CD69+表達(dá)的比較(均n=4,%)

注：與CON組比較，1)P<0．05,2)P<0．01；與ISO組比較，3)P<0．05，4)P<0．01

[本文圖1見(jiàn)封3]

3討論

目前認(rèn)為ISO誘導(dǎo)的心肌損傷與心肌相對(duì)缺血缺氧、膜通透性改變、氧自由基損傷等有關(guān)[5]。AST、CK、LDH水平及心肌病理學(xué)改變是評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞損害程度的重要指標(biāo)[6]。本研究采用連續(xù)注射ISO使心肌氧化應(yīng)激劇增促進(jìn)氧自由基聚集，細(xì)胞膜通透性增高，肌漿內(nèi)的可溶性酶大量釋放入血，導(dǎo)致血清心肌酶AST、LDH、CK水平顯著升高，心肌局灶性壞死明顯，與以往研究[4,6]相符。

研究表明，DEX預(yù)處理可減輕缺血再灌注后心肌損傷程度，減少炎性因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、干擾素-α(IFN-α)的表達(dá)，使炎癥反應(yīng)控制在一定的水平[7,8]。本文觀察了DEX預(yù)處理及后處理對(duì)急性心肌缺血損傷效應(yīng)，結(jié)果顯示，DEX預(yù)處理組心肌損傷較ISO組明顯減輕，DEX后處理組心肌損傷較ISO組無(wú)明顯改變，證實(shí)DEX預(yù)處理對(duì)ISO致小鼠急性心肌缺血損傷具有明顯保護(hù)作用，而損傷后給予DEX治療則無(wú)保護(hù)作用。

CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞都是炎性T細(xì)胞，通過(guò)分泌細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，起到誘導(dǎo)和輔助細(xì)胞免疫及體液免疫的作用。CD69于T淋巴細(xì)胞激活后最早表達(dá)，通過(guò)抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，同時(shí)可作為共刺激信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖[9]。有研究表明急性心肌梗死患者淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8功能長(zhǎng)期嚴(yán)重失調(diào)，降低了機(jī)體免疫功能，引起心肌損傷和心室重塑[10]；應(yīng)用外源性生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)CD3、CD4、CD8表達(dá)水平可以輔助治療[11]。本文流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，ISO損傷后小鼠脾臟組織CD8+和CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)均有上升，而且心肌組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示這些T細(xì)胞參與了心肌損傷的病理過(guò)程。經(jīng)DEX預(yù)處理的小鼠脾臟組織CD4+和CD8+T細(xì)胞均顯著下降，抑制性T細(xì)胞CD4+CD69+表達(dá)顯著上升，心肌炎性細(xì)胞減少，表明DEX預(yù)處理可能對(duì)損傷心肌細(xì)胞起到重要保護(hù)作用。但另外一種抑制性T細(xì)胞 CD8+CD69+T細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯變化，對(duì)此現(xiàn)象有待進(jìn)一步觀察論證。DEX后處理組只表現(xiàn)為CD8+T細(xì)胞表達(dá)下降，其余T細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯變化。因此認(rèn)為DEX預(yù)處理對(duì)免疫功能的改變是其對(duì)心肌缺血缺氧保護(hù)作用重要機(jī)制之一。

綜上所述,在ISO所致急性心肌缺血損傷中，DEX預(yù)處理可以明顯改善心肌損傷,而DEX后處理沒(méi)有這種作用。該結(jié)果提示DEX可預(yù)防ISO介導(dǎo)的心肌損傷，其作用機(jī)制可能與DEX介導(dǎo)的T細(xì)胞亞群免疫應(yīng)答功能改變有關(guān)。同時(shí)也為DEX預(yù)處理治療不穩(wěn)定型心絞痛，尤其是急性心肌梗死超早期應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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張嚴(yán)高(1964-)，男，漢族，主任醫(yī)師，主要從事老年心血管疾病及療養(yǎng)保健工作

參考文獻(xiàn)

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Effects of Dexamethasone on Acute Myocardial Injury induced by Isoproterenol and T Cells in Spleen

ZHANG Yan-gao1， YU Lei2, WANG Jian-li2, ZU Min-xiang3，*,YIN Dai-jia-jia1

1The First Department of Sanatorium, Hangzhou Sanatorium of Nangjing Military Area Command, Hangzhou 310007,China；2Institute of Immunology,Medicine School of Zhejiang University, Hangzhou 310058,China；3Department of Neurosurgery, 117 Hospital of PLA,Hangzhou 310013,China；*Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate potential protective effect of glucocorticoid receptor(GR)agonist dexamethasone(DEX) on isoproterenol(ISO)-induced myocardial injury and the possible mechanism．Method: The sixteen mice were randomly divided into control(CON) group(n=4)，ISO group(n=4), dexamethasone pretreatment(DEX+ISO) group (n=4)and dexamethasone treatment(ISO+DEX) group(n=4).ISO group, DEX+ISO group and ISO+DEX group received 5mg/kg isoproterenol hydrochloride, daily intraperitoneal injection of 1 time, continuous 3 days.DEX+ISO group given dexamethasone(1.25mg/kg)injection by intraperitoneal injection as a pretreatment before treatment 30 minutes. At the 2nd and 3rd day, dexamethasone(1.25mg/kg) was given after ISO injected 30 minutes in ISO+DEX group. The serum AST, LDH, CK, and CK-MB were detected. Myocardial tissue injury was assessed by HE staining.Flowcytometry was adopted to detect the expression of T cell subpopulation.Results: ①Compared with control group，the levels of AST,LDH and CK were significantly increased；the degree of myocardial injury were greatly deteriorated in ISO group(P<0.01);the expression 0f CD8+T cells and CD4+CD69+T cells were greatly increased(P<0.05,P<0.01).②Compared with ISO group ,the levels of AST and CK was significantly reduced(P<0.01);the levels of LDH and CK-MB were reduced(P<0.05);the degree of myocardial injury was greatly improved(P<0.01) in DEX+ISO group; the expression of CD4+T cells and CD8+T cells were significantly reduced(P<0.01),the expression of CD4+CD69+T cells were significantly increased(P<0.01) in DEX+ISO group.③Compared with ISO group ,the expression of CD8+T cells were reduced(P<0.05) and the other wasn't difference (P>0.05) in ISO+DEX group.Conclusion: DEX pretreatment has protective effect against ISO-induced myocardial injury. The mechanism might be the transformation of immune function．

【Key words】Dexamethasone;Isoproterenol;Myocardial injury; CD4+;CD8+;CD69+;Mice Debonera等[1]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對(duì)肝臟缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用，并首次證實(shí)地塞米松(Dexamethasone,DEX)通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路減輕實(shí)質(zhì)性臟器缺血-再灌注損傷，為臨床提供了新的選擇和理論支持。目前研究提示抑制炎癥反應(yīng)可減輕急性心肌缺血損傷，以及DEX預(yù)處理對(duì)心臟、腎臟缺血-再灌注損傷有早期保護(hù)和延遲保護(hù)作用[2，3]。但DEX預(yù)處理或治療對(duì)急性心肌缺血損傷的影響機(jī)制研究較少。本文觀察DEX預(yù)處理和后處理對(duì)異丙腎上腺素(Isoprotereno，ISO)致急性心肌缺血損傷小鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)、心肌組織結(jié)構(gòu)和脾臟免疫T細(xì)胞的影響，為臨床應(yīng)用的可行性提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

[中圖分類號(hào)]R542.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2016)02-0009-05

第一作者簡(jiǎn)介：本文

本文2015-12-10收到，2016-01-26修回