趙惠茹，郭德喜，李 娜，靖 會(huì)，楊 靜，楊 陽(yáng)，侯 進(jìn)

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；3.陜西師范大學(xué) 西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710119；4.西安醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710021)

槐米為2015版 《中國(guó)藥典》 收載的豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥花蕾及花。性微寒，味苦。具有抗炎、抗病毒、祛痰、止咳、維生素P樣、抑制醛糖還原酶等作用[1-3]。活性成分主要是黃酮類，對(duì)其薄層色譜鑒別已有不少報(bào)道，常用的吸附劑為硅膠或聚酰胺，展開劑為V(甲醇)∶V(水)=1∶1或V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)∶V(水)=8∶1∶1[4-5]。但由于槐米中化學(xué)成分類型復(fù)雜，其中的黃酮類成分種類繁多，經(jīng)典的薄層色譜分離效果并不十分理想，而近年來微乳薄層色譜在中藥有效成分的分離鑒定方面運(yùn)用得比較廣泛[6-10]，但是應(yīng)用微乳液作為展開劑分離鑒定槐米中黃酮類成分的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此該研究以聚酰胺為固定相，微乳液為展開劑，考察微乳液類型、表面活性劑、助表面活性劑、油相、改性劑對(duì)槐米中黃酮類成分分離效果的影響，為槐米中黃酮的薄層色譜定性鑒別提供準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

蘆丁對(duì)照品：批號(hào)為 00081-201007，中國(guó)藥品生物制品檢定所；槐米：陜西省藥材公司，由西安醫(yī)學(xué)院楊靜教授鑒定為SophorajaponicaL的花蕾；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

四用紫外分析儀：ZF-8，上海嘉鵬科技有限公司；電子天平：FA1004B，上海越平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器：AS3120，Auto Science 公司；薄層色譜用聚酰胺薄膜：臺(tái)州四青生化材料廠；點(diǎn)樣毛細(xì)管：華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；薄層層析玻璃缸：上海信誼儀器廠。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品12.5 mg用適量甲醇溶解并定容至50 mL的容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取10 g槐米加無(wú)水乙醇100 mL回流提取兩次，每次1.5 h，合并提取液回收溶劑，將殘?jiān)?00 mL熱水超聲至溶解，用90 mL石油醚萃取3次，將水層用90 mL正丁醇分3次萃取，合并萃取液，回收正丁醇，取適量用甲醇溶解，微孔濾膜過濾，得供試品溶液1。精密稱取10 g槐米加質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的乙醇100 mL，回流提取兩次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮，取適量用甲醇稀釋，微孔濾膜過濾，得供試品溶液2。

1.3 微乳薄層色譜展開劑的配制

按照m(十二烷基硫酸鈉)∶m(正丁醇)∶m(正己烷)=2.7∶6.3∶1.0精密稱取各試劑[6]，加適量水?dāng)嚢枞芙?，再加水?0 g，超聲5 min，靜置24 h 備用。

1.4 薄層層析方法

用點(diǎn)樣毛細(xì)管分別吸取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1、供試品溶液2各1～2 μL，在聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，分別以實(shí)驗(yàn)所需的不同組成和結(jié)構(gòu)的微乳液為展開劑，或以硅膠為吸附劑，展開劑為V(甲醇)∶V(水)=1∶1或V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)∶V(水)=8∶1∶1,在室溫條件下上行展開。展距約8 cm，取出后揮干展開劑，以m(三氯化鋁) ∶V(乙醇)= 1%g/mL溶液噴灑薄層板面，晾干后用四用紫外分析儀在365 nm下檢識(shí)。

2 結(jié)果與討論

2.1 微乳液展開劑的組成及結(jié)構(gòu)

按照“1.3”方法配制實(shí)驗(yàn)所用微乳液，其組成及結(jié)構(gòu)見表1，十二烷基硫酸鈉為表面活性劑，正丁醇為助表面活性劑。

表1 微乳液的組成及結(jié)構(gòu)

2.2 微乳薄層色譜分離條件的選擇

2.2.1 微乳展開劑φ(水)的考察

應(yīng)用表1中不同組成和結(jié)構(gòu)的微乳液為展開劑，按照“1.4”項(xiàng)進(jìn)行聚酰胺薄層層析，以斑點(diǎn)數(shù)目、斑點(diǎn)清晰度和展開時(shí)間為指標(biāo)，展開效果見表2。

從表2可以看出，隨著微乳液φ(水)的增加，展開斑點(diǎn)個(gè)數(shù)逐漸增多，斑點(diǎn)清晰度由模糊到清晰再變模糊，所用展開時(shí)間逐漸縮短。φ(水)= 15%～55%的微乳液展開時(shí)間偏長(zhǎng)，分離效果欠佳；φ(水)=75%的微乳液展開斑點(diǎn)數(shù)目最多，且比較清晰，展開時(shí)間適中，分離效果較理想。根據(jù)以上結(jié)果選擇φ(水)=75%的O/W微乳液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

表2 不同φ(水)的微乳薄層展開效果

2.2.2 微乳液中不同油相的考察

以φ(水)=75%的微乳液-甲酸(體積比9∶1)為展開劑，分別以正己烷、正庚烷、乙酸乙酯、正丁酸乙酯為油相，在聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，在紫外燈(365 nm)下檢視，以斑點(diǎn)數(shù)目、斑點(diǎn)清晰度為指標(biāo)，考察樣品溶液在不同油相的微乳薄層展開劑中的展開效果。結(jié)果可見，以正己烷為油相的微乳展開劑分離得到的斑點(diǎn)數(shù)目多，斑點(diǎn)圓潤(rùn)清晰，拖尾不明顯，Rf值適中，展開效果較其它三種油相好。故選擇正己烷為油相的微乳液作展開劑。

2.2.3 微乳液中助表面活性劑種類的考察

以正己烷為油相，以φ(水)=75%的微乳液-甲酸(體積比9∶1)為展開劑。分別以甲醇、乙醇和正丁醇為助表面活性劑，在聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，在365 nm下檢視，以斑點(diǎn)清晰度和斑點(diǎn)數(shù)目為指標(biāo)，考察樣品溶液在不同助表面活性劑組成的微乳展開劑中的薄層展開效果，結(jié)果見圖1。

從左向右依次為甲醇,乙醇,正丁醇a-蘆丁對(duì)照品；b-供試品溶液1；c-供試品溶液2圖1 不同助表面活性劑的微乳薄層色譜

由圖1可見，與甲醇和乙醇相比，當(dāng)以正丁醇為助表面活性劑時(shí)展開效果好。因此選擇以正丁醇為助表面活性劑的微乳液作展開劑。

2.2.4 微乳液中表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比的考察

以正己烷為油相，十二烷基硫酸鈉(SDS)為表面活性劑，正丁醇為助表面活性劑，以φ(水)=75%的微乳液-甲酸(體積比9∶1)為展開劑。參照文獻(xiàn)[3,7]中SDS的用量，在十二烷基硫酸鈉和正丁醇總質(zhì)量不變的情況下，m(SDS)∶m(正丁醇)分別為1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3進(jìn)行薄層層析，以斑點(diǎn)數(shù)目和斑點(diǎn)清晰度為指標(biāo)，對(duì)比樣品在不同表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比的微乳展開劑中的薄層展開效果。結(jié)果見圖2。可見，當(dāng)m(SDS)∶m(正丁醇)=3∶7時(shí)，分離得到的斑點(diǎn)數(shù)目最多，斑點(diǎn)圓潤(rùn)且各斑點(diǎn)之間分離度大，Rf值適中，分離效果最好。

從左向右依次為m(SDS)∶m(正丁醇)=1∶9，2∶8，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，3∶7a-蘆丁對(duì)照品；b-供試品溶液1；c-供試品溶液2圖2 不同表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比微乳液薄層色譜圖

2.2.5 微乳液中不同改性劑的考察

按照上述優(yōu)化條件，分別以甲酸、丙酮、V(甲酸)∶V(丙酮)= 1∶1、4∶1為改性劑，用點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取樣品溶液和蘆丁對(duì)照品溶液適量，點(diǎn)樣，展開，取出晾干，噴以m(三氯化鋁) ∶V(乙醇)= 1%g/mL溶液，晾干后在365 mm下檢視，以斑點(diǎn)數(shù)目、斑點(diǎn)清晰度為指標(biāo)。結(jié)果表明，用甲酸作改性劑分離得到的斑點(diǎn)數(shù)有8個(gè)，斑點(diǎn)圓潤(rùn)且斑點(diǎn)之間分離度大，Rf值適中；丙酮作改性劑，分離得到的斑點(diǎn)數(shù)目較少且拖尾嚴(yán)重；當(dāng)加入不同比例的甲酸和丙酮時(shí)分離斑點(diǎn)數(shù)目較少，Rf值偏大。對(duì)比分析可知，用甲酸作改性劑效果最佳。

2.2.6 微乳液中不同量甲酸的考察

在以上優(yōu)化的微乳配方中加入改性劑甲酸，并使V(微乳液)∶V(甲酸)分別為9∶0、9∶1、9∶2，以此作為展開劑，于聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，展距約8 cm，取出晾干，依法顯色和檢識(shí)，以斑點(diǎn)數(shù)目、斑點(diǎn)清晰度為指標(biāo)。薄層色譜結(jié)果見圖3。由圖3可見，當(dāng)加入甲酸，使V(微乳液)∶V(甲酸)=9∶1時(shí)樣品分離得到的斑點(diǎn)多，且拖尾現(xiàn)象也有明顯的改善，分離效果更好。因此選擇φ(水)=75%的微乳液和甲酸體積比9∶1作為展開劑。

從左向右依次為V(微乳液)∶V(甲酸)= 9∶0，9∶1，9∶2a-蘆丁對(duì)照品；b-供試品溶液1；c-供試品溶液2圖3 不同酸度的微乳液薄層色譜圖

2.3 微乳薄層色譜與常規(guī)分離方法比較

選擇黃酮類化合物常用的2種展開系統(tǒng)V(甲醇)∶V(水)=1∶1和V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)∶V(水)=8∶1∶1，與φ(水)=75%的微乳液-甲酸(體積比9∶1)為展開劑，按照1.4項(xiàng)進(jìn)行聚酰胺薄層層析，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，當(dāng)用φ(水)=75%的微乳液-甲酸(體積比9∶1)作為展開劑時(shí)，分離清晰度較高，斑點(diǎn)圓潤(rùn)，無(wú)拖尾現(xiàn)象，而用其它2種展開系統(tǒng)時(shí)，完全分離的斑點(diǎn)數(shù)目很少，可見此微乳展開系統(tǒng)比普通有機(jī)溶劑系統(tǒng)在槐米中黃酮類成分的分離鑒定方面具有一定的優(yōu)越性。

3 結(jié) 論

(1) 槐米中的黃酮類化合物可以用聚酰胺為吸附劑，φ(水)=75%的微乳液[m(SDS)∶m(正丁醇)∶m(正己烷)= 2.7∶6.3∶1.0]和改性劑甲酸按體積比9∶1作展開劑進(jìn)行分離，噴以m(三氯化鋁) ∶V(乙醇)= 1%g/mL溶液后在紫外燈(365 nm)下觀察，斑點(diǎn)較圓潤(rùn)不拖尾，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，有較好的分離效果。樣品在微乳液中展開的效果優(yōu)于硅膠薄層色譜，可能是由于分配于微乳水相中的是極性大的黃酮苷，分配于微乳油相中的是極性小的黃酮苷元[11]。由于分配、吸附、疏水等效應(yīng)，使槐米黃酮中結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差別細(xì)微的組分均能較好的分離；

(2) 實(shí)驗(yàn)曾選用水作為溶劑提取槐米中的黃酮類物質(zhì)，其它實(shí)驗(yàn)條件不變，結(jié)果斑點(diǎn)數(shù)目較少且Rf較大，各斑點(diǎn)分離界限比較模糊。后分別改用φ(水)=75%乙醇和無(wú)水乙醇作為溶劑進(jìn)行提取，相同條件展開顯色，可見無(wú)論是無(wú)水乙醇還是φ(水)= 75%乙醇提取的樣品展開后沒有顯著差異，斑點(diǎn)數(shù)目較多，且Rf較小的組分分離效果也比較理想，分析可能是由于用水作為溶劑時(shí)，槐米中一些極性較小的苷元沒有被充分提出，而乙醇溶解能力強(qiáng)，溶解范圍廣，故選擇用無(wú)水乙醇或φ(水)=75%乙醇來提取樣品；

(3) 用優(yōu)選的微乳液替代了毒性大、污染大、可能會(huì)致癌的有機(jī)溶劑，主要成分為水，揮發(fā)性較小，成本低，對(duì)操作人員身體損害小。且實(shí)驗(yàn)操作受溫度、濕度的影響不大，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好，檢測(cè)的靈敏度高。加之微乳液具有比膠束體系更大的增溶量和超低的表面張力[12-13]，色譜效率顯著提高。

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