宋慧芳，　郭　蕊，　張　亮

(山西醫(yī)科大學(xué) 1人體解剖學(xué)教研室， 2形態(tài)學(xué)實驗室， 3第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

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低氧預(yù)處理通過激活A(yù)KT通路提高老年hBM-MSCs對氧化應(yīng)激損傷的耐受能力*

宋慧芳1△，郭蕊2，張亮3△

(山西醫(yī)科大學(xué)1人體解剖學(xué)教研室，2形態(tài)學(xué)實驗室，3第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

[摘要]目的： 探討低氧預(yù)處理對老年人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBM-MSCs)的保護作用，為提高老年自體干細胞移植治療效果提供實驗支持。方法: 老年hBM-MSCs于低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進行低氧預(yù)處理，實驗分為年輕hBM-MSCs組(young組)，老年hBM-MSCs組(old組)及低氧預(yù)處理老年hBM-MSCs組(old+hypoxia組)。300 μmol/L H2O2作用30 min建立細胞氧化應(yīng)激模型，50 μmol/L LY294002作用2 h阻斷PI3K/AKT信號通路，BrdU摻入實驗檢測細胞增殖能力； CCK-8法檢測細胞活力，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達水平和AKT磷酸化水平。結(jié)果: BrdU摻入實驗顯示低氧預(yù)處理的老年hBM-MSCs細胞陽性率為39.85%±3.45%，與old組相比增殖能力顯著提高(P<0.05)。300 μmol/L H2O2作用30 min誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激后，old+hypoxia組與old組比較，細胞活力顯著提高(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達量顯著降低(P<0.05)，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達量顯著增高(P<0.05)，且AKT磷酸化水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；應(yīng)用LY294002抑制PI3K/AKT信號通路后，細胞活力下降(P<0.05)。結(jié)論: 低氧預(yù)處理可以通過激活A(yù)KT信號通路提高老年人骨髓間充質(zhì)干細胞活力及增殖能力。

[關(guān)鍵詞]低氧； PI3K/AKT信號通路； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 氧化應(yīng)激

骨髓間充質(zhì)干細胞易分離培養(yǎng)，體外擴增，并具有多向分化潛能，是干細胞移植治療的理想種子細胞。自體干細胞移植能夠克服移植遠期免疫排斥及倫理學(xué)等問題，是針對冠狀動脈粥樣硬化、腦梗死等缺血性疾病較為有前景的治療手段[1-4]。但老年患者自體干細胞增殖能力差，同時移植局部的缺血缺氧環(huán)境使得活性氧簇生成增多，引起局部氧化還原水平失調(diào)，老年干細胞對此氧化應(yīng)激的微環(huán)境耐受力差，使得移植到損傷局部的細胞存活率低，增殖能力不足，影響治療效果[5-6]。

已有研究報道低氧預(yù)處理可減輕心肌細胞、內(nèi)皮細胞等體細胞的缺血損傷，同時經(jīng)過低氧預(yù)處理的間充質(zhì)干細胞移植后，也能夠提高移植受體的干細胞對體細胞的保護作用，對干細胞本身亦具有一定的保護作用[7]，但老年干細胞反應(yīng)性降低，本研究擬探討低氧預(yù)處理能否提高老年骨髓間充質(zhì)干細胞自身的存活及增殖能力及其可能的機制。

材料和方法

1人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBM-MSCs)的分離及體外培養(yǎng)

在病人知情同意的前提下，無菌條件收集無明顯血液系統(tǒng)及全身系統(tǒng)性疾病患者骨髓3～5 mL，并依據(jù)患者年齡分為年輕(20～30歲)和老年(大于60歲)2組。采用我室建立的全貼壁法[8]于10% FBS-IMDM培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)2組人骨髓間充質(zhì)干細胞。培養(yǎng)基中含青霉素1×105U/L, 鏈霉素1×105U/L及2 mmol L-谷氨酰胺。常規(guī)體外培養(yǎng)，傳代至第3～4代用于相關(guān)實驗檢測。

2主要方法

2.1細胞分組實驗細胞分為老年(old)組(大于60歲的老年供體來源hBM-MSCs，常氧培養(yǎng))、年輕(young)組(20～30歲之間年輕供體來源hBM-MSCs，常氧培養(yǎng))、氧預(yù)處理老年(old+hypoxia)組(大于60歲的老年供體來源hBM-MSCs，低氧預(yù)處理24 h)。

2.2細胞低氧預(yù)處理細胞在Thermo Scientific低氧(1% O2、5% CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進行低氧預(yù)處理，而后進行后續(xù)干預(yù)實驗及相關(guān)指標(biāo)檢測，正常對照組使用同樣培養(yǎng)基(10% FBS-IMDM)于常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激 hBM-MSCs中加入300 μmol/L H2O2于常氧培養(yǎng)箱中作用30 min以誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激后，即刻進行后續(xù)相關(guān)檢測。

2.4LY294002抑制PI3K/AKT信號通路細胞貼壁后，在進行低氧預(yù)處理及H2O2誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激前加入含50 μmol/L LY294002的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h以阻斷PI3K/AKT信號通路的激活。

2.5BrdU摻入實驗檢測細胞增殖能力無菌24孔板接種細胞，內(nèi)附無菌圓玻片，各組細胞貼壁后，加入含10 μmol/L BrdU的10% FBS-IMDM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)72 h后4%多聚甲醛固定。 PBS洗3次后用2 N鹽酸37 ℃孵育10 min使DNA變性，10%山羊血清封閉，濕盒中I抗4 ℃孵育過夜(小鼠抗BrdU，1∶100, Abtech)，II 抗37 ℃避光孵育2 h(山羊抗小鼠Cy3熒光 II 抗，1∶100,康為公司)，DAPI染核，水溶性抗熒光淬滅封片劑封片。顯微鏡拍片、計數(shù)BrdU陽性細胞數(shù)(紅色)及DAPI著色的細胞總數(shù)(藍色)，計算BrdU陽性率以檢測細胞增殖能力。

2.6CCK-8實驗檢測細胞活力無菌96孔板接種細胞，各組細胞接種密度一致，均為每孔2 000個，依照CCK-8實驗試劑盒檢測流程操作，酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度(A)值反映細胞活力。

2.7Western blot實驗含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的磷酸化蛋白提取裂解液提取蛋白，蛋白定量后行SDS電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，I 抗于4 ℃過夜孵育，TBST充分清洗后相應(yīng)II 抗37 ℃孵育2 h，ECL顯影曝光，使用Image J計算條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照計算相對蛋白量。

3統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，經(jīng)過或未經(jīng)過低氧預(yù)處理的兩組老年hBM-MSCs 檢測指標(biāo)的均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗，3組比較使用單因素方差分析，隨后用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1低氧預(yù)處理對老年人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力的影響

BrdU摻入實驗結(jié)果顯示，old組hBM-MSCs的BrdU陽性率為24.55%±6.17%， 較young組顯著降低(P<0.01)。經(jīng)低氧預(yù)處理的老年hBM-MSCs BrdU陽性率增高至39.85%±3.45%，與old組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，但仍顯著低于young組(P<0.01)，見圖1。

2低氧預(yù)處理對氧化應(yīng)激條件下老年hBM-MSCs活力的影響

3組細胞經(jīng)300 μmol/L H2O2作用30 min誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，CCK-8法檢測細胞活力，結(jié)果顯示在氧化應(yīng)激條件下，old組細胞活力顯著降低，相當(dāng)于young組的49.81%±7.80%(P<0.01)，經(jīng)過低氧預(yù)處理的老年hBM-MSCs雖然其活力仍然低于young組(P<0.01)，但較old組顯著提高，相當(dāng)于young組的66.30%±6.24%(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The effect of hypoxic preconditioning on the proliferation of old hBM-MSCs by BrdU incorporation. Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs old group;##P<0.01 vs old+hypoxia group.

圖1BrdU摻入法檢測低氧預(yù)處理對老年hBM-MSCs增殖能力的影響

Figure 2.The effect of hypoxic preconditioning on the cell viability of H2O2stimulated-old hBM-MSCs by CCK-8 assay. Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs old group;##P<0.01 vs old+hypoxia group.

圖2CCK-8法檢測低氧預(yù)處理對氧化應(yīng)激條件下老年hBM-MSCs活力的影響

3低氧預(yù)處理有效降低氧化應(yīng)激引起的老年hBM-MSCs凋亡

3組細胞經(jīng)300 μmol/L H2O2作用30 min誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達水平。實驗結(jié)果顯示與old組相比，低氧預(yù)處理組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達量顯著降低(P<0.05)，同時抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達量顯著增高(P<0.05),見圖3。

4低氧預(yù)處理可激活老年hBM-MSCs中AKT蛋白

低氧預(yù)處理的老年人骨髓間充質(zhì)干細胞中磷酸化AKT(p-AKT)蛋白顯著增強，與正常培養(yǎng)的老年人骨髓間充質(zhì)干細胞相比，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，提示低氧預(yù)處理可以激活A(yù)KT信號通路,見圖4。

5抑制AKT活化減弱低氧預(yù)處理對老年hBM-MSCs的保護作用

CCK-8法實驗結(jié)果顯示，低氧預(yù)處理可以提高氧化應(yīng)激條件下老年hBM-MSCs的細胞活力(P<0.01)，抑制劑LY294002組細胞活力低于未使用抑制劑組(P<0.05)，但仍高于未經(jīng)過低氧預(yù)處理的普通老年hBM-MSCs組(P<0.05),見圖5。

Figure 3.The effect of hypoxic preconditioning on the apoptosis of H2O2stimulated-old hBM-MSCs.Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs old group;##P<0.01 vs old+hypoxia group.

圖3低氧預(yù)處理對氧化應(yīng)激條件下老年hBM-MSCs凋亡水平的影響

Figure 4.AKT protein phosphorylation in hypoxically preconditioned old hBM-MSCs. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs old group.

圖4低氧預(yù)處理對老年hBM-MSCs中AKT蛋白磷酸化的影響

Figure 5.The cell viability of old hBM-MSCs in the presence or absence of PI3K/AKT pathway inhibitor (LY294002). Mean±SD. n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs H2O2group;#P<0.05 vs hypoxic precondition+H2O2group.

圖5PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對氧化應(yīng)激條件下老年hBM-MSCs活力的影響

討論

冠狀動脈粥樣硬化、腦梗死等缺血性疾病發(fā)病率高，致死率高，是危害人類健康的主要疾病，尤其是隨著年齡增長，其發(fā)病風(fēng)險和死亡率隨之增高，已成為老年人群的高發(fā)病和主要死亡原因[9]。自體干細胞移植治療是新的較有前景的治療手段，但作為缺血性疾病自體干細胞移植的主要受眾——老年患者，其老年干細胞對于移植局部氧化應(yīng)激的微環(huán)境耐受能力差，移植細胞凋亡率高，存活率低，活力差，成為限制其治療效果的主要瓶頸[5-6]。因而迫切需要尋找提高干細胞尤其是老年自體干細胞移植后局部干細胞數(shù)量和活力的有效手段，為改善老年患者自體干細胞移植治療效果提供技術(shù)支持。

已有研究顯示，利用番茄紅素等藥物處理干細胞，c-Maf、血紅素加氧酶等基因改建干細胞或是micro-RNAs等干預(yù)干細胞可以提高移植干細胞的存活率[5, 10-13]，但我們提高干細胞存活率的主要目的是指向改善臨床移植治療預(yù)后，因而需要更加具有臨床應(yīng)用安全性的非化學(xué)試劑處理，非基因修飾等方式。低氧預(yù)處理是在細胞應(yīng)用前于低氧培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，使之對低氧高活性氧簇的生長環(huán)境預(yù)適應(yīng)，從而提高細胞活力的干預(yù)方式，已有研究證實此種處理方式對肝細胞、腦細胞、心肌細胞等體細胞以及年輕干細胞具有保護作用[7]，我們的研究結(jié)果證實給予老年人骨髓干細胞低氧預(yù)處理24 h同樣可以顯著降低凋亡水平，增加細胞活力。

PI3K/AKT信號通路是生物體內(nèi)非常重要的信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，亦是應(yīng)激狀態(tài)下影響細胞存活的重要信號通路。 已有研究報道證實間充質(zhì)干細胞衰老進程中AKT磷酸化水平顯著降低，通過增強AKT信號通路的活化，可以顯著抑制老年間充質(zhì)干細胞凋亡，提示PI3K/AKT通路活化不足可能是干細胞衰老眾多機制中的一環(huán)[14-17]。本文觀察到低氧預(yù)處理老年骨髓間充質(zhì)干細胞，可顯著提高AKT磷酸化水平，提示AKT信號通路被激活是低氧預(yù)處理提高老年人骨髓間充質(zhì)干細胞存活及增殖能力的可能機制；同時應(yīng)用LY294002阻斷PI3K/AKT信號通路，低氧預(yù)處理對老年骨髓間充質(zhì)干細胞的保護作用明顯降低，更進一步證實AKT通路參與了這一過程。但我們亦觀察到阻斷PI3K/AKT信號通路后，低氧預(yù)處理對老年干細胞的保護作用雖明顯減弱但并未完全喪失，提示可能尚有其它信號通路及分子機制參與此過程，因此尚需要在今后課題進展中進一步探討。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Hypoxic preconditioning increases tolerant ability of old human bone marrow mesenchymal stem cells to oxidative stress injury through AKT pathway

SONG Hui-fang1, GUO Rui2, ZHANG Liang3

(1Department of Anatomy，2Morphology Laborator，3The Second Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China. E-mail: songhuifang0111@yeah.net； ZL81vip@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effect of hypoxic preconditioning on human bone marrow mesenchymal stem cells (hBM-MSCs), and to provide basic experimental support for more effective autologous stem cell transplantation in aged patients. METHODS: The old hBM-MSCs were subjected to hypoxic preconditioning using a hypoxia incubator chamber for 24 h. The cells were divided into young group, old group and old+hypoxia group (with 24 h hypoxic preconditioning). Hydrogen peroxide (H2O2, 300 μmol/L) was applied to simulate the oxidative stress. The cells were treated with 50 μmol/L LY294002 for 2 h to inhibit PI3K/AKT pathway. BrdU incorporation and CCK-8 assay were used for analyzing the cell proliferation and viability. The protein levels of Bax, Bcl-2 and p-AKT were measured by Western blot. RESULTS: BrdU-positive cells, which represented the cell proliferation, and the cell viability were significantly increased in old+hypoxia group compared with old group (P<0.05). The protein level of Bax decreased (P<0.05) and Bcl-2 increased (P<0.05) in old+hypoxia group compared with old group after using 300 μmol/L H2O2 simulate. the oxidative stress. The phosphorylation of AKT was enhanced by hypoxic preconditioning in old group (P<0.05). The protective effect of hypoxic preconditioning on the cell survival was decreased after treated with LY294002 (inhibitor of the PI3K/AKT pathway) (P<0.05). CONCLUSION: Hypoxic preconditioning increases the survival and proliferation of old hBM-MSCs by activation of AKT pathway.

[KEY WORDS]Hypoxia; PI3K/AKT signal pathway; Bone marrow mesenchymal stem cells; Oxidative stress

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0912- 05

[收稿日期]2016- 02- 18[修回日期] 2016- 04- 07

*[基金項目]山西醫(yī)科大學(xué)青年基金資助項目(No. 02201002)；山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院331基金資助項目(No. 201217)

通訊作者△宋慧芳 Tel: 0351-4135787; E-mail: songhuifang0111@yeah.net; 張亮 Tel: 0351-3365402; E-mail: ZL81vip@126.com

[中圖分類號]R363

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.024

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net