黃　華，　丁　菁，　粟　鳳，　張　倩，　陸德琴

(貴州醫(yī)科大學病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

?

葛根素預處理上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達減輕人臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷*

黃華，丁菁，粟鳳，張倩，陸德琴△

(貴州醫(yī)科大學病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

[摘要]目的： 探討葛根素(puerarin，PUE)預處理對缺氧/復氧(hypoxia reoxygenation，H/R)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的保護作用。方法: HUVECs隨機分為正常對照(control)組、H/R組、單純PUE組和PUE+H/R組(1.0×10-3mol/L PUE預處理24 h后進行H/R)。采用Western blot方法檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表達，化學比色法檢測組成型一氧化氮合酶(cNOS)的活性，TUNEL法檢測細胞凋亡。此外，在PUE預處理前使用ERK蛋白激酶抑制劑U0126(1.0×10-5mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制劑LY294002(5.0×10-5mol/L)處理細胞1 h，再進行H/R。結(jié)果: 與control組相比，H/R組的eNOS蛋白表達水平降低(P<0.05)，PUE預處理上調(diào)eNOS蛋白的表達水平(P<0.05)，該上調(diào)作用均可被U0126及LY294002抑制(P<0.05)；與control組相比，H/R組的cNOS活力下降(P<0.05)，PUE預處理組的cNOS活力增加(P<0.05)；與control組相比，H/R組細胞凋亡指數(shù)顯著增大(P<0.01)，PUE預處理組的細胞凋亡指數(shù)減小(P<0.01)。結(jié)論: H/R可使HUVECs受損傷，eNOS蛋白表達及活性降低，細胞凋亡增加。PUE預處理可通過ERK1/2信號通路和PI3K/Akt信號通路上調(diào)HUVECs的eNOS蛋白表達，增強eNOS活性，減少細胞凋亡，發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用。

[關鍵詞]葛根素； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 缺氧/復氧； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)廣泛存在于嚴重創(chuàng)傷與缺血性疾病治療后。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞的功能障礙和結(jié)構損傷是IRI早期的病理改變和始動因素，在IRI發(fā)生、發(fā)展的過程中起著重要的作用。生理情況下血管內(nèi)皮細胞分泌的一氧化氮(nitric oxide，NO)在調(diào)節(jié)血管舒縮、凝血和纖溶，以及防止氧自由基損傷等方面起著重要作用。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是生成NO的關鍵限速酶，血管系統(tǒng)中的NO主要來源于內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)。已公認eNOS/NO功能受損是內(nèi)皮細胞功能障礙的一個重要表現(xiàn)，因此eNOS/NO常作為反映血管內(nèi)皮細胞功能的重要指標之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)葛根素(puerarin，PUE)具有擴張冠狀動脈、抗缺血再灌注損傷、改善血液流變學等心血管保護等作用[2]。然而目前有關PUE對內(nèi)皮細胞IRI時eNOS功能的影響報道較少。本研究使用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，建立體外培養(yǎng)細胞H/R損傷模型模擬細胞IRI，探討PUE預處理減輕內(nèi)皮細胞H/R損傷的保護機制。

材料和方法

1實驗試劑及儀器

HUVECs由貴州醫(yī)科大學曾柱教授惠贈；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素(HyClone)；葛根素注射液(成都天臺山制藥有限公司)；NOS活性(分型)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PVDF蛋白雜交膜(Millipore)；ECL增強化學發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物公司)；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)抑制劑U0126、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)抑制劑LY294002(Sigma);兔抗鼠eNOS抗體、兔抗鼠β-tubulin抗體及辣根過氧化酶標記的山羊抗兔 Ⅱ 抗(Santa Cruz)；兔抗人 Ⅷ 因子相關抗原抗體、兔抗人CD34抗體(北京博奧森生物公司)；SABC法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；BX41顯微鏡(OLYMPUS)。

2主要方法

2.1HUVECs細胞的培養(yǎng)HUVECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液 1 次，當細胞生長接近于80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，傳代。實驗用傳10代以內(nèi)的細胞。

2.2細胞鑒定細胞爬片后，放入 6 孔板中培養(yǎng)。待細胞生長至50%時，用無血清培養(yǎng)基靜止12h后，PBS洗滌3次，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用兔抗人Ⅷ因子相關抗原抗體和兔抗人CD34抗體作為Ⅰ抗，按1∶100比例稀釋，SABC法進行免疫細胞化學染色。PBS孵育作為陰性對照。鏡下胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。200倍顯微鏡下隨機取5個視野，計算陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2.3缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷細胞模型制備參照文獻[3]，將含體積分數(shù)為99.99%的高純氮氣經(jīng)過濾后通入無FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)節(jié)氣體流速為6～8 L/min，通氣2 min，后將上述低糖培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，再向培養(yǎng)瓶內(nèi)充氮氣，流速為6～8 L/min，時間5 min。旋緊培養(yǎng)瓶瓶蓋，封口膠密封瓶口，放入37 ℃孵箱中分別缺氧培養(yǎng)2 h(H2)、4 h(H4)和8 h(H8)。缺氧培養(yǎng)結(jié)束后，所有細胞更換含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基后，繼續(xù)在常氧條件下(37℃、5% CO2)復氧培養(yǎng)4 h(R4)。

2.4實驗分組待HUVECs生長融合達70%～80%左右時，使用無FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基靜止12 h。(1)缺氧/復氧和PUE預處理實驗：HUVECs隨機分為control組、H2/R4組、H4/R4組和H8/R4組，在預處理實驗中，根據(jù)文獻[4-5]報道的具有明顯內(nèi)皮細胞保護作用的PUE劑量，control組和H/R各組均預先用終濃度1.0×10-3mol/L的PUE預處理24 h。(2)特異性蛋白激酶抑制劑實驗：取H4/R4組進行實驗，抑制劑組在PUE預處理前先使用ERK1/2抑制劑U0126(終濃度1.0×10-5mol/L)或PI3K/Akt抑制劑LY294002(終濃度5.0×10-5mol/L)預處理1 h，并分別設立抑制劑單純用藥和溶媒對照。細胞隨機分為control組、H4/R4組、PUE組、PUE+H4/R4組、U0126+PUE+H4/R4、U0126+PUE組、U0126組、LY294002+PUE+H4/R4組、LY294002+PUE組、LY294002組和溶媒對照DMSO組。

2.5Western blot檢測蛋白水平分別收集各組細胞，加入蛋白裂解液，4 ℃裂解，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，余蛋白變性后用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，按相應 Ⅰ 抗比例稀釋(eNOS 1∶750，β-tubulin 1∶4 000)，4℃孵育過夜。次日TBST洗膜后，加入 Ⅱ 抗(1∶5 000)，常溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光。凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并分析灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參照，結(jié)果以目的條帶和β-tubulin條帶積分吸光度比值表示，以正常對照組積分吸光度值為100%。以上結(jié)果至少重復3 批獨立實驗，每批重復檢測3次。

2.6化學比色法檢測HUVECs 組成型NOS(constitutive NOS, cNOS)活性各組在實驗觀察時點結(jié)束時，按試劑盒說明書操作收集、處理細胞、檢測cNOS活性，即使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，重懸，1 000 r/min離心5 min，得到細胞沉淀。加入PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心6 min，棄上清，重復洗滌2次。在細胞沉淀中加入300 μL的PBS，混勻，超聲粉碎細胞，取上清進行蛋白濃度測定和cNOS檢測。所有檢測均復3孔。

2.7TUNEL法檢測細胞凋亡細胞爬片后，放入25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細胞生長至40%～50%，用無血清培養(yǎng)基靜止12 h，PUE預處理及H/R培養(yǎng)方法如前所述。實驗結(jié)束時取出玻片，按照TUNEL試劑盒(POD法)說明書的操作步驟進行細胞凋亡的檢測。經(jīng)DAB顯色和蘇木素復染、脫水封片后，顯微鏡下觀察染色情況。鏡下細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性細胞。顯微鏡下(×200)隨機取5個視野，計算細胞凋亡指數(shù)%=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1細胞鑒定結(jié)果

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的HUVECs細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕黃色顆粒，Ⅷ因子相關抗原和CD34表達陽性，陰性對照未見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，見圖1。計算陽性細胞率為100%。

2PUE預處理上調(diào)eNOS蛋白表達

如圖2所示，缺氧2 h、4 h和8 h后復氧4 h(H2/R4、H4/R4和H8/R4)，隨著缺氧時間的延長，各組細胞eNOS蛋白表達水平與control組相比逐漸降低(P<0.05)；單純PUE預處理組eNOS蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，PUE+H/R各組eNOS蛋白表達水平均高于同時點H/R組(P<0.05)。

Figure 1.The expression of factor VIII-related antigen and CD34 in HUVECs (SABC，×200). A: negative control; B: the positive expression of factor VIII-related antigen; C: negative control; D: the positive expression of CD34.

圖1Ⅷ因子相關抗原和CD34在HUVECs細胞中的表達

Figure 2.The protein expression of eNOS in the HUVECs treated with H/R and/or PUE. Mean±SD. n=9.▲P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs H2/R4 group;△P<0.05 vs H4/R4 group;*P<0.05 vs H8/R4 group;☆P<0.05 vs PUE group.

圖2H/R與PUE預處理各組eNOS蛋白表達

3PUE預處理增加cNOS活性

如圖3所示，與control組相比較，隨著缺氧時間延長，H/R各組細胞cNOS活性逐漸降低(P<0.05)，與同時點H/R組比較，應用PUE預處理后各組cNOS活性明顯增加(P<0.05)。

Figure 3.The changes of cNOS activity in each group. Mean±SD. n=3.▲P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs H2/R4 group;△P<0.05 vs H4/R4 group;*P<0.05 vs H8/R4 group;☆P<0.05 vs PUE group.

圖3各組cNOS活性的變化

4PUE預處理減少HUVECs細胞凋亡

Control組及PUE組細胞生長良好，僅偶見細胞凋亡發(fā)生。H4/R4組細胞凋亡指數(shù)明顯高于control組(P<0.01)；經(jīng)PUE預處理后，細胞凋亡指數(shù)明顯降低 (P<0.01),見圖4、5。

Figure 4.The apoptosis of HUVECs (TUNEL, ×200). A: negative control group; B: control group; C: H4/R4 group; D: PUE group; E: PUE+H4/R4 group.

圖4HUVECs細胞凋亡情況5UO126及LY294002抑制PUE預處理上調(diào)的eNOS蛋白表達

如圖6所示，與control組相比，H4/R4組eNOS蛋白表達水平降低(P<0.05)，單純PUE預處理組和PUE+H4/R4組eNOS蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與H4/R4組相比，PUE組和PUE+H4/R4組eNOS蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)；與單純PUE預處理組比較，U0126+PUE+H4/R4組、U0126+PUE組、LY294002+PUE+H4/R4組和LY294002+PUE組eNOS蛋白表達水平降低(P<0.05)；與PUE+H4/R4組比較，U0126+PUE+H4/R4組、U0126+PUE組、LY294002+PUE+H4/R4組和LY294002+PUE組eNOS蛋白表達水平降低(P<0.05)；與control組相比，U0126組、LY294002組和DMSO組eNOS蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 5.The apoptotic index of HUVECs in each group. Mean±SD. n=5.▲▲P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs H4/R4 group;**P<0.01 vs PUE group.

圖5各組HUVECs細胞凋亡指數(shù)

討論

當IRI發(fā)生時，血管內(nèi)皮細胞的功能異常發(fā)生時間早于實質(zhì)細胞的損傷，且內(nèi)皮細胞受損可引起血栓和粥樣斑塊形成、血管痙攣，進一步使實質(zhì)細胞的損傷加劇，因此有效保護血管內(nèi)皮細胞是預防和治療IRI損傷的關鍵。本實驗使用的HUVECs經(jīng)鑒定為高純度內(nèi)皮細胞，因此可用于模擬血管內(nèi)皮在H/R損傷時結(jié)構和功能的改變。

Figure 6.U0126 and LY294002 inhibited the protein expression of eNOS up-regulated by PUE pretreatment. Mean±SD. n=9.▲P<0.05 vs control group;△P<0.05 vs H4/R4 group;#P<0.05 vs PUE group;*P<0.05 vs PUE+H4/R4 group.

圖6U0126及LY294002抑制PUE預處理上調(diào)的eNOS蛋白表達

PUE是從豆科植物葛根提取的一種異黃酮成分，是葛根的主要活性成分。近些年研究表明PUE可上調(diào)大鼠心肌缺血模型心肌細胞eNOS 蛋白的表達和增加NO的產(chǎn)生[8-9]。本研究采用文獻[4-5]報道的具有明顯內(nèi)皮細胞保護作用的PUE劑量1.0×10-3mol/L對HUVECs進行預處理，結(jié)果顯示，與同時點的H/R組比較，PUE預處理各組使eNOS蛋白表達明顯增加，cNOS活性明顯增強。

那么PUE是通過哪些細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路來上調(diào)eNOS蛋白表達及其活性呢？研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)多條信號通路如蛋白激酶A[10]、PI3K/Akt[11]、ERK1/2[12]等均可以使eNOS蛋白表達增加，而PUE可以通過激活蛋白激酶ERK1/2[13]、PI3K/Akt[14]等信號通路發(fā)揮生物學作用。因此本研究在PUE預處理的基礎上分別加用了ERK1/2特異性抑制劑U0126和PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002，以觀察在H/R過程中PUE是否通過這2條信號通路發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論在正常培養(yǎng)條件下還是H/R培養(yǎng)條件下，PUE上調(diào)eNOS蛋白表達的作用均被抑制。提示PUE上調(diào)內(nèi)皮細胞eNOS 蛋白表達可由ERK1/2信號通路及PI3K/Akt信號通路介導。

本實驗發(fā)現(xiàn)HUVECs細胞在H/R后細胞凋亡指數(shù)較control組明顯增高。這主要是由于在H/R過程中，細胞膜脂質(zhì)過氧化反應增強，使細胞內(nèi)大量氧自由基生成，且細胞抗氧化酶的活性降低，致使內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡[15]。而研究發(fā)現(xiàn)PUE可以通過清除氧自由基、增加抗氧化酶活性從而發(fā)揮抗氧化保護作用[16]。本研究觀察到，與H/R組比較，PUE預處理后細胞凋亡指數(shù)顯著降低。

綜上所述，H/R后內(nèi)皮細胞eNOS蛋白表達明顯下降及活性顯著減弱、細胞發(fā)生凋亡，PUE預處理可通過激活ERK1/2和PI3K/Akt信號通路，使eNOS的蛋白表達上調(diào)及活性增強，減少細胞凋亡，從而發(fā)揮內(nèi)皮保護作用。

[參考文獻]

[1]楊春華,林水金,楊映波,等. NO在血管內(nèi)皮細胞損傷中的標志作用[J]. 中華急診醫(yī)學雜志, 1999, 8(3):160-161.

[2]韓春妍. 葛根素治療相關疾病的研究[J]. 實用藥物與臨床, 2012, 3(3):178-180.

[3]宋振舉,楊光田,陸德琴,等. 缺氧與復氧對腦動脈內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶Ⅲ表達的影響[J]. 中國危重病急救醫(yī)學, 2003, 15(9):535-537.

[4]王春玲, 傅攀峰, 李宏偉,等. 葛根素對血管內(nèi)皮細胞DNA損傷的保護作用[J]. 中國微循環(huán), 2004, 8(6):361-364.

[5]劉青. 葛根素調(diào)節(jié)支架內(nèi)狹窄炎癥反應的機制研究[D]. 北京中醫(yī)藥大學, 2007.

[6]Chen C, Jiang J, Lü JM, et al. Resistin decreases expression of endothelial nitric oxide synthase through oxidative stress in human coronary artery endothelial cells[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 299(1):H193-H201.

[7]張倩,丁菁,陸德琴,等. 依普利酮對高鹽誘導的高血壓大鼠主動脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達及活性的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(9):1606-1610.

[8]溫葭,陳士林,Filly Cheung,等. 葛根素對心肌細胞一氧化氮影響的研究[J]. 中國心血管病研究雜志, 2006, 4(10):777-779.

[9]Zhang SY, Chen G, Wei PF, et al. The effect of puerarin on serum nitric oxide concentration and myocardial eNOS expression in rats with myocardial infarction[J]. J Asian Nat Prod Res, 2008, 10(3-4):323-328.

[10]Si H, Yu J, Jiang H, et al. Phytoestrogen genistein up-regulates endothelial nitric oxide synthase expression via activation of cAMP-responsive element-binding protein in human aortic endothelial cells[J]. Endocrinology, 2012, 26(7):3190-3198.

[11]Sun N, Wang H, Wang L. Vaspin alleviates dysfunction of endothelial progenitor cells induced by high glucose via PI3K/Akt/eNOS pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(1):482-489.

[12]Mata-Greenwood E, Liao WX, Zheng J, et al. Differential activation of multiple signalling pathways dictates eNOS upregulation by FGF2 but not VEGF in placental artery endothelial cells[J]. Placenta, 2008, 29(8):708-717.

[13]唐哲明, 梁國榮. 葛根素通過ERK1/2信號通路促進內(nèi)皮細胞增殖[J]. 四川生理科學雜志, 2012, 34(2):55-57.

[14]馬亞飛,劉新偉,喬欣,等. 葛根素通過PI3K/Akt途徑對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的抑制[J]. 中國老年學雜志, 2010, 30(8):1077-1079.

[15]徐慧,文薏,譚虹. 卡托普利晚期預處理對人內(nèi)皮細胞缺氧復氧損傷保護作用機制的研究[J]. 中國心血管病研究, 2013, 11(4):296-299.

[16]高培國,強輝,凌鳴. 葛根素對過氧化氫誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J]. 西安交通大學學報：醫(yī)學版, 2012, 33(2):245-248.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Puerarin pretreatment protects human umbilical vein endothelial cells against hypoxia/reoxygenation injury via increasing protein expression of endothelial nitric oxide synthase

HUANG Hua, DING Jing, SU Feng, ZHANG Qian, LU De-qin

(Department of Pathophysiology, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China. E-mail: dqlu91@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effects of puerarin (PUE) pretreatment on hypoxia/reoxygenation (H/R) injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), as well as its possible mechanism and the signal transduction pathways involved. METHODS: HUVECs were randomly divided into normal control group, H/R group, PUE pretreatment group and PUE+H/R group (1.0×10-3mol/L, PUE pretreated the cells for 24 h before H/R). The protein expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was measured by Western blot. The activity of constitutive NOS (cNOS) was determined via chemical colorimetric methods. Apoptosis of HUVECs was detected by TUNEL assay. In addition, the cells were treated with ERK inhibitor U0126 (1.0×10-5mol/L) or PKB/Akt inhibitor LY294002 (5.0×10-5mol/L) for 1 h before PUE pretreatment, and then H/R was performed.RESULTS: Compared with control group, H/R decreased the protein expression of eNOS (P<0.05), and PUE pretreatment up-regulated it (P<0.05). This effect of PUE was inhibited by U0126 or LY294002 (P<0.05). Compared with control group, the activity of cNOS decreased in H/R group (P<0.05), while it increased after PUE pretreatment (P<0.05). Compared with control group, the apoptotic index significantly increased in H/R group (P<0.01). PUE pretreatment reduced the apoptotic index (P<0.01). CONCLUSION: H/R decreases the protein expression and enzyme activity of eNOS in HUVECs, and induces apoptosis of HUVECs. PUE pretreatment up-regulates the protein expression and enzyme activity of eNOS, and reduces the apoptosis of HUVECs with H/R injury. The protective effect of PUE might be through increasing eNOS protein expression via ERK1/2 and PKB/Akt signaling pathways.

[KEY WORDS]Puerarin; Human umbilical vein endothelial cells; Hypoxia/reoxygenation; Endothelial nitric oxi-de synthase

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0857- 06

[收稿日期]2015- 11- 20[修回日期] 2016- 01- 28

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No.31460267)；貴州省社會發(fā)展攻關項目 [黔科合 SY 字(2013)3019號]

通訊作者△Tel： 0851-88416116； E-mail: dqlu91@hotmail.com

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.015

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net