王曉鋒，王玉平，魏文珍，胡曉丹，李瑞英，周永寧

蘭州大學第一醫(yī)院 1.消化科；2.甘肅省胃腸病重點實驗室；3.感染科，甘肅 蘭州 730000

Wdr5通過Wnt通路促進肝癌細胞增殖

王曉鋒1,2,3，王玉平1,2，魏文珍1,2，胡曉丹1,2，李瑞英1,2，周永寧1,2

蘭州大學第一醫(yī)院 1.消化科；2.甘肅省胃腸病重點實驗室；3.感染科，甘肅 蘭州 730000

目的 研究Wdr5對肝癌細胞增殖的影響及其可能的機制。方法 構(gòu)建Wdr5的shRNA病毒感染肝癌細胞系Huh7和HepG2下調(diào)Wdr5的表達，進而通過克隆形成實驗和MTT等方法檢測下調(diào)Wdr5表達后對細胞增殖的影響。結(jié)果 下調(diào)Wdr5后，肝癌細胞系Huh7和HepG2的克隆形成、細胞增殖能力顯著降低，Wnt通路關(guān)鍵基因APC和β-catenin顯著降低。結(jié)論 下調(diào)Wdr5能抑制肝癌細胞增殖，這一過程可能是通過Wnt通路進行的。

Wdr5；肝癌；增殖；Wnt通路；APC；β-catenin

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是最常見的致死性惡性腫瘤之一[1-2]。我國肝癌的發(fā)病率和死亡率都顯著高于世界平均水平[3-4]。由于絕大多數(shù)的肝癌確診時已處于晚期，常規(guī)的手術(shù)以及介入、放化療等手段已經(jīng)難以奏效[5-6]。深入研究肝癌發(fā)生的分子和細胞學機制，將為肝癌的早期診斷、預防和治療提供新的理論基礎[7-8]。Wdr5(WD repeat-containing protein 5) 是WD-40蛋白家族的成員之一，同時也是染色體H3修飾蛋白復合體Trithorax group(TrxG)的重要組分之一[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)Wdr5在胚胎干細胞的全能性維持、分化及腫瘤形成等過程中發(fā)揮著重要的作用[11-16]。其異常激活并持續(xù)性活動與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17-19]。然而關(guān)于Wdr5在肝癌細胞中的功能和具體機制的相關(guān)研究并未見報道。本研究通過慢病毒系統(tǒng)干擾Wdr5在肝癌細胞系Huh7和HepG2中的表達，進而研究Wdr5對肝癌細胞的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與試劑 人肝癌細胞293T細胞、Huh7和HepG2(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)，MTT(美國Sigma公司)，細胞基礎培養(yǎng)基(MEM，美國Hyclone公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司)，特級胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)，PLVX-shRNA2(美國clontech公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%，美國Gibco公司)，Polybrene(美國Sigma公司)，100×雙抗(青霉素+鏈霉素，美國Gibco公司)，DNA轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD(瑞士羅氏公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，Wdr5、Gapdh、APC、β-catenin抗體(英國abcam公司)，shRNA引物以及定量PCR引物合成(上海生工)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng): Huh7細胞和HepG2細胞培養(yǎng)于含10%特級胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/ml的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 Wdr5 shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建、病毒包裝及感染： shRNA序列從Sigma-Aldrich公司的網(wǎng)站上獲得，具體序列見表1。在病毒包裝時，將上述質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒通過FuGene HD轉(zhuǎn)染進293T細胞中，8 h之后換液，48 h之后收集第1批病毒樣本，72 h之后再收集第2批病毒樣本，用0.22 μm的濾器過濾除菌。感染肝癌細胞系采用懸浮感染的方式。肝癌細胞消化計數(shù)之后，將2×105個細胞鋪于6孔板中，每個孔中加入1 ml普通培養(yǎng)基和0.5 ml病毒液，每個孔再加入1.5 μl的polybrene(8 μg/ml polybrene)，12 h之后，將病毒液換成新鮮的培養(yǎng)基，并進行傳代。每個感染的細胞都帶有綠色熒光標記，通過流式細胞儀篩選出感染了病毒的細胞。

1.2.3 定量PCR： Trizol一步法提取總RNA。每個樣本加0.5 μg的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。定量PCR的擴增條件為：預變性：94 ℃ 4 min；循環(huán)：94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。定量PCR檢測采用automated Stratagene Mx3000 QPCR system，以Gapdh為內(nèi)參。采用2-△△CT方法進行分析。

1.2.4 Western blotting蛋白檢測: 需要收集的細胞樣本用PBS洗1次，消化后計數(shù)，將相同數(shù)目的細胞收集到1.5 ml EP管中，采用1×SDS上樣緩沖液對細胞進行裂解，在95 ℃的金屬浴中熱變性5 min后進行下一步實驗。

表1 shRNA和定量PCR引物序列

Tab 1 Primer sequences of shRNA and quantitative RCR

名稱序列(5′→3′)shWdr5APFgatccCCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGTTTTTgshWdr5APRaattcAAAAACCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGgshWdr5BPFgatccCCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGTTTTTgshWdr5BPRaattcAAAAACCAACCTTATTGTCTCAGGATCTCGAGATCCTGAGACAATAAGGTTGGgWdr5PFAATTCAGCCCGAATGGAGAGTWdr5PRAGGCTACATCGGATATTCCCAGAPCPFAAAATGTCCCTCCGTTCTTATGGAPCPRCTGAAGTTGAGCGTAATACCAGTβ?cateninPFCATCTACACAGTTTGATGCTGCTβ?cateninPRCATCTACACAGTTTGATGCTGCTGapdhPFGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGapdhPRGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

1.2.5 克隆形成實驗: 將細胞樣本用PBS洗1遍，消化之后進行計數(shù)。克隆形成實驗用6孔板進行，每個樣本在每個孔中加500個細胞，3 d后換液，之后每隔2 d換液，10 d后進行檢測。細胞吸去培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入甲醇進行固定20 min，之后去除固定液在室溫晾置10～15 min，待固定液干了之后，加入1%(w/v)結(jié)晶紫染液進行染色，染色30 min，棄去染液，用5 ml/孔超純水洗滌3次，棄去洗滌液，室溫靜置5～10 min，待洗滌液風干后，在光學顯微鏡下觀察克隆形態(tài)，然后用數(shù)碼相機拍照，記錄每孔形成克隆數(shù)目的情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 4.0軟件處理，應用Student’s t-test進行檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Wdr5-shRNA慢病毒感染肝癌細胞系鑒定 為了研究Wdr5在肝癌細胞系中的作用，我們構(gòu)建了兩個Wdr5的shRNA：shWdr5 A和shWdr5 B。在測序檢測結(jié)果顯示正確之后，將這兩個shRNA質(zhì)粒和對照質(zhì)粒共同包裝病毒，收集病毒后進行肝癌細胞的感染。為了排除細胞系的影響，我們采用了兩個肝癌細胞系：Huh7和HepG2。感染2 d后發(fā)現(xiàn)許多細胞攜帶綠色熒光，提示感染成功，進行2次傳代后進行流式細胞儀篩選，重新鋪板之后進行檢測，兩個細胞系的樣本中細胞攜帶有綠色熒光，表明感染病毒成功(見圖1)。

2.2 Wdr5-shRNA慢病毒干擾效果檢測 對Huh7中Wdr5的干擾效果進行檢測，定量PCR結(jié)果顯示，Wdr5的表達水平降低，shWdr5 A和shWdr5 B都具有非常顯著的干擾效果(見圖2A)。又在蛋白水平檢測shWdr5 A和shWdr5 B的干擾效果，結(jié)果顯示，在蛋白水平，Wdr5的表達也被顯著抑制，這與mRNA表達的結(jié)果一致(見圖2C)。在HepG2細胞中也通過定量PCR和Western blotting檢測了Wdr5的表達效果，結(jié)果與Huh7的結(jié)果一致(見圖2B、2D)。

2.3 干擾Wdr5能抑制肝癌細胞系增殖 在成功構(gòu)建Wdr5干擾細胞系后，進一步檢測Wdr5被干擾之后對肝癌細胞增殖的影響。MTT實驗顯示，在Huh7細胞中，干擾Wdr5后，與對照組比較，干擾組細胞增殖能力明顯降低(見圖3A)。為了進一步驗證這一結(jié)果，又在HepG2細胞中進行檢測，結(jié)果顯示干擾組的細胞增殖能力與對照組比較明顯降低，與Huh7的結(jié)果非常一致(見圖3B)。同時，也通過克隆形成實驗結(jié)果對肝癌細胞系的增殖能力進行研究，與之前MTT實驗結(jié)果也一致(見圖3C、3D)。

圖1 Wdr5-shRNA慢病毒能夠高效感染Huh7細胞系和HepG2細胞系(100×) A : Huh7細胞系；B: HepG2細胞系

Fig 1 Huh7 and HepG2 cells were infected by Wdr5-shRNA through lentiviral transfection(100×) A: Huh7 cells B: HepG2 cells

圖2Wdr5-shRNA慢病毒能夠在Huh7細胞系和HepG2細胞系中有效沉默Wdr5的表達A：qRT-PCR檢測Huh7細胞系中Wdr5的表達；B：qRT-PCR檢測HepG2細胞系中Wdr5的表達；C：Westernblotting檢測Huh7細胞系中Wdr5的表達；D：Westernblotting檢測HepG2細胞系中Wdr5的表達

Fig2TheexpressionofWdr5inHuh7andHepG2cellsweresignificantlydownregulatedaftertansfectionA:theexpressionofWdr5wasdetectedbyqRT-PCRinHuh7;B:theexpressionofWdr5wasdetectedbyqRT-PCRinHepG2;C:theexpressionofWdr5wasdetectedbyWesternblottinginHuh7;D:theexpressionofWdr5wasdetectedbyWesternblottinginHepG2

圖3 沉默Wdr5能夠抑制肝癌細胞增殖A：MTT法檢測Huh7細胞增殖；B：MTT法檢測HepG2細胞增殖；C：Huh7細胞系的細胞克隆形成；D：HepG2細胞系的細胞克隆形成

Fig3ThecolonyformationandcellproliferationwereallinhibitedafterWdr5knockdownA：theHuh7proliferationwasobservedbyMTT;B:theHepG2proliferationwasobservedbyMTT;C:theHuh7proliferationwasobservedbycolonyformationassays;D:theHepG2proliferationwasobservedbycolonyformationassays

2.4 干擾Wdr5能抑制Wnt通路 定量PCR結(jié)果顯示：在Huh7細胞中，Wdr5被干擾后，Wnt通路關(guān)鍵基因APC和β-catenin的表達被顯著下調(diào)(見圖4A、4B)。進一步的Westernblotting結(jié)果顯示，在蛋白水平，這兩個關(guān)鍵基因的表達也被抑制(見圖4C)。

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖4 沉默Wdr5基因能夠抑制Wnt通路的表達 A：qRT-PCR檢測APC基因的表達；B：qRT-PCR檢測β-catenin基因的表達；C：Western blotting檢測APC基因和β-catenin基因的表達

Fig 4 The expression levels of APC and β-catenin were all down-regulated after Wdr5 knockdown A: the expression of APC was detected by qRT-PCR; B: the expression of β-catenin was detected by qRT-PCR; C: the expression of APC and β-catenin were detected by Western blotting

3 討論

目前，肝癌是國內(nèi)發(fā)病率和死亡率第2高的惡性腫瘤。深入研究肝癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，找出肝癌中的關(guān)鍵基因或者表面標記基因，將為肝癌的臨床診斷、臨床治療和藥物開發(fā)提供重要意義。在這一研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個影響肝癌細胞的重要基因：WD-40蛋白Wdr5。它對肝癌細胞的增殖具有重要的作用，當它被干擾時，肝癌細胞系Huh7和HepG2的表達都被顯著抑制，這一影響并沒有細胞系特異性，因此它可能對肝癌細胞具有較為普遍的作用。這一結(jié)果顯示，Wdr5表達量的高低可以反映肝癌細胞的增殖能力，當肝癌細胞高表達Wdr5時，細胞增殖能力強。在臨床上，Wdr5可以作為反映肝癌增殖能力及惡性程度的一個潛在指標。

Wdr5是染色體H3修飾蛋白復合體TrxG的重要組分之一，當H3的第4位賴氨酸被TrxG催化三甲基化時，則能降低染色體的折疊，促進染色體的開放，進而促進所在基因的表達。因此高表達Wdr5能促進基因的表達，而干擾Wdr5則能抑制基因的表達。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)Wdr5被干擾后能夠抑制Wnt通路重要蛋白APC和β-catenin的表達。Wdr5可能通過影響APC和β-catenin等基因的啟動子區(qū)的組蛋白H3K4的甲基化修飾來調(diào)節(jié)這兩個基因的表達，當然這還需要進一步的研究。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)Wdr5對肝癌細胞系的增殖具有重要調(diào)節(jié)作用，且這一作用的重要機制之一是它能夠影響Wnt通路中的關(guān)鍵基因APC和β-catenin的表達，這對肝癌增殖調(diào)節(jié)的研究和肝癌的診斷治療應用具有重要的價值。

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(責任編輯：王全楚)

Wdr5 promoting cells proliferation in hepatocelluar carcinoma through Wnt signaling pathway

WANG Xiaofeng1,2,3, WANG Yuping1,2, WEI Wenzhen1,2, HU Xiaodan1,2, LI Ruiying1,2, ZHOU Yongning1,2

1.Department of Gastroenterology; 2.The Key Laboratory for Gastrointestinal Diseases of Gansu Province; 3.Department of Infectioous Diseases, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Objective To study the effect of Wdr5 on cells proliferation in hepatocellular carcinoma by constructing the Wdr5 knock-out cell models.Methods Two shRNAs targeting Wdr5 were generated: shWdr5 A and shWdr5 B, and then infected Huh7 and HepG2 cells by lentiviral transfection. The expression of Wdr5 was detected by qPCR and Western blotting. MTT and colony formation assays were used to observe the effect of Wdr5 on cell proliferation. The expressions of APC and β-catenin were also tested at mRNA and protein level after Wdr5 silencing. Results The expression of Wdr5 in Huh7 and HepG2 cells was significantly down regulated after tansfection. The colony formation and cell proliferation were all inhibited after Wdr5 knockdown. And the expressions of APC and β-catenin were all down-regulated after Wdr5 knockdown.Conclusion Down regulating the expression of Wdr5 could inhibit the cells proliferation of hepatocellular carcinoma, and this could be involved in the regulation of APC and β-catenin in Wnt pathway.

Wdr5; Hepatocelluar carcinoma; Proliferation; Wnt; APC; β-catenin

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.014

R735.7

A

1006-5709(2016)11-1262-05

2016-03-09