宋宗昌, 郭長(zhǎng)升, 趙鵬飛, 唐家宏, 韓懷忠, 張立新, 沈利群, 郭春亮, 岳榮喜

解放軍第一五五中心醫(yī)院血液腫瘤科/開封市血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 開封 475003

下調(diào)PRR11表達(dá)抑制胃癌HGC-27細(xì)胞增殖和侵襲

宋宗昌, 郭長(zhǎng)升, 趙鵬飛, 唐家宏, 韓懷忠, 張立新, 沈利群, 郭春亮, 岳榮喜

解放軍第一五五中心醫(yī)院血液腫瘤科/開封市血液病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 開封 475003

目的 研究富含脯氨酸蛋白11(Proline-rich protein 11，PRR11)表達(dá)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并初步探討相關(guān)分子機(jī)制。方法 利用載有PRR11 shRNA的慢病毒及空載體慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌HGC-27細(xì)胞系，建立PRR11蛋白低表達(dá)細(xì)胞系及陰性對(duì)照細(xì)胞系。Western blotting方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HGC-27細(xì)胞中PRR11蛋白表達(dá)；采用CCK-8和Transwell小室分別研究?jī)山M細(xì)胞增殖與侵襲能力的差異。采用Western blotting檢測(cè)胃癌細(xì)胞中cyclin D1和MMP-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 PRR11蛋白低表達(dá)HGC-27細(xì)胞較對(duì)照組HGC-27細(xì)胞的增殖和侵襲能力減弱，PRR11蛋白低表達(dá)細(xì)胞中cyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)較少。結(jié)論 PRR11低表達(dá)介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力減弱，可能與cyclinD1和MMP-2表達(dá)減少密切相關(guān)。

胃癌；PRR11；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

胃癌是世界上第四大常見的惡性腫瘤，是引起腫瘤性死亡的第二大病因[1-2]。我國(guó)胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，僅次于肺癌、肝癌。2014年，我國(guó)新增胃癌患者約32.5萬，其中男性約22.1萬，女性約10.4萬，并有逐年增加的趨勢(shì)。由于胃癌的篩查工作尚未在我國(guó)廣泛開展，得到早期診斷的患者較少，有效的治療手段有限，雖然近年來胃癌的治療效果有所提高，但整體狀況還不令人滿意。手術(shù)仍是胃癌根治的唯一方法，由于大多數(shù)胃癌在診斷時(shí)往往處于中晚期，失去手術(shù)根治的時(shí)機(jī)，只有選擇放、化療及靶向藥物等治療方法，效果很不理想，中位存活時(shí)間多在7～10個(gè)月[3-4]。因此尋找影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵性生物大分子，對(duì)于胃癌的篩查、早期診斷、有效治療及準(zhǔn)確判斷預(yù)后具有十分重要的意義。

富含脯氨酸蛋白11(Proline-rich protein 11, PRR11)基因位于人類染色體17q22，PRR11是一個(gè)富含脯氨酸的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量為40 085 Da[5-6]。最初研究發(fā)現(xiàn)PRR11在肺癌組織中高表達(dá)，與肺癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，是肺癌患者的不良預(yù)后因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PRR11大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中具有非常重要的作用[7]。目前越來越多的研究顯示，PRR11在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如食管癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膽管癌等，而在相應(yīng)正常組織中低表達(dá)，并且具有顯著差異；研究結(jié)果還表明PRR11高表達(dá)是這些腫瘤預(yù)后不良的重要因素之一[8]。 但在胃癌中的研究尚局限于其表達(dá)狀況與臨床病理特征的相關(guān)性分析方面，但其作用機(jī)制尚不清楚，本研究利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)胃癌HGC-27細(xì)胞中PRR11基因表達(dá)，研究其表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 胃癌HGC-27細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人PRR11、β-actin、cyclin D1和MMP-2抗體購(gòu)自abcam公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；transwell小室購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司。含PRR11 shRNA 慢病毒及空載體慢病毒由上海GENECHEM公司提供。shRNA慢病毒中含有靶向PRR11 mRNA的siRNA(5′-ACGCAGGCCUUAAGGAGAATT-3′)，空載體慢病毒中含有一段無意義錯(cuò)配序列作為陰性對(duì)照。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染 胃癌HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞覆蓋率為85%左右時(shí)，按說明書將含PRR11 shRNA的慢病毒及空載體慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌HGC-27細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為兩組：PRR11表達(dá)敲低組細(xì)胞(PRR11-KD細(xì)胞)、陰性對(duì)照組細(xì)胞(PRR11-NC細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染后48 h Western blotting方法檢驗(yàn)干擾效果。

1.3 細(xì)胞增殖分析 選擇轉(zhuǎn)染成功且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PRR11-KD細(xì)胞及PRR11-NC細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)，37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h；更換等量新鮮培養(yǎng)液后，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h左右，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的吸光度值。

1.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 將兩組細(xì)胞分別懸浮于含有0.2%胎牛血清的培養(yǎng)基中，以1×104個(gè)細(xì)胞/100 μl的規(guī)格依次接種于鋪好matrigel膠的transwell小室的上室中，每組細(xì)胞重復(fù)3個(gè)小室。下室中加入500 μl含5%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20 h，取出Transwell小室，PBS沖洗2遍，5%戊二醛固定，加入0.1%結(jié)晶紫室溫下染色0.5 h，PBS沖洗2遍，棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，通過計(jì)算濾膜下層的細(xì)胞數(shù)評(píng)估其侵襲的細(xì)胞數(shù)量(每個(gè)小室選擇10個(gè)視野，100×)。

1.5 Western blotting 建立穩(wěn)定的PRR11-KD細(xì)胞系及PRR11-NC細(xì)胞系后，收集選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、覆蓋率約85%的細(xì)胞，利用蛋白裂解液分別提取兩組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將兩種蛋白溶液分別稀釋至濃度近似，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉液，完全覆蓋PVDF膜，置搖床上震蕩封閉1 h，加入兔抗人Ⅰ抗(PRR11、β-actin、cyclinD1和MMP-2)(1∶5 000)，4 ℃ 冰箱過夜。次日，加入山羊抗兔IgGⅡ抗(1∶5 000)，室溫下?lián)u床上反應(yīng)1 h。將PVDF膜置于凝膠成像儀內(nèi)，取化學(xué)發(fā)光顯色液試劑A和試劑B，按照1∶1比例混勻，滴加至PVDF膜上，至完全覆蓋，成像。利用Gene Tools軟件分析蛋白表達(dá)的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量為待測(cè)蛋白與β-actin蛋白的比值。

2 結(jié)果

2.1 PRR11 shRNA導(dǎo)致胃癌HGC-27細(xì)胞中PRR11表達(dá)下降 Western blotting結(jié)果顯示，PRR11-KD細(xì)胞和PRR11-NC細(xì)胞中PRR11均有表達(dá)，PRR11-KD細(xì)胞中PRR11表達(dá)量顯著低于PRR11-NC細(xì)胞(P<0.05)，PRR11-KD細(xì)胞中PRR11表達(dá)量?jī)H為PRR11-NC細(xì)胞中PRR11表達(dá)量21%(見圖1)。

圖1 病毒轉(zhuǎn)染后兩組HGC-27細(xì)胞中PRR11表達(dá)

Fig 1 PRR11 expression of HGC-27 cells after viral transfection

2.2 PRR11表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致胃癌HGC-27細(xì)胞增殖能力下降 在96孔板中，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng)PRR11-KD細(xì)胞及PRR11-NC細(xì)胞，24 h、48 h、72 h及96 h后利用CCK-8進(jìn)行活細(xì)胞量檢測(cè)，結(jié)果顯示，與PRR11-NC細(xì)胞相比，PRR11-KD細(xì)胞增殖受到明顯抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 見圖2)。

2.3 PRR11表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致胃癌HGC-27細(xì)胞侵襲能力下降 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PRR11-NC細(xì)胞相比(細(xì)胞穿膜數(shù)為179.00±27.06)，PRR11-KD細(xì)胞(細(xì)胞穿膜數(shù)為73.67±13.61)的穿膜數(shù)量顯著減少(P=0.000)，提示PRR11-KD細(xì)胞侵襲能力下降。

圖2 PRR11表達(dá)下調(diào)抑制胃癌HGC-27細(xì)胞增殖

Fig 2 Down-regulation of PRR11 expression inhibited proliferation of HGC-27 cells

2.4 PRR11表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致胃癌HGC-27細(xì)胞中cyclinD1和MMP-2表達(dá)下降 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，PRR11-KD細(xì)胞中cyclinD1和MMP-2相對(duì)表達(dá)量分別為0.15±0.04、0.31±0.09，PRR11-NC細(xì)胞中cyclinD1和MMP-2相對(duì)表達(dá)量分別為0.61±0.13、0.73±0.11。PRR11-KD細(xì)胞中cyclinD1 和MMP-2表達(dá)量顯著低于PRR11-NC細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.05, 見圖3)。

圖3 PRR11表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞中cyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)的影響

Fig 3 Down-regulation of PRR11 expression impacted the expressions of cyclinD1 and MMP-2 of HGC-27 cells

3 討論

PRR11基因是美國(guó)國(guó)家健康機(jī)構(gòu)哺乳動(dòng)物基因收集項(xiàng)目通過全部測(cè)序的方法，首次從人類全長(zhǎng)cDNA中鑒定出來的一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因[9-10]。人類基因命名委員會(huì)將其系統(tǒng)命名為HGNC:25619。該基因位于人類染色體17q22，包含51 211個(gè)堿基，含有10個(gè)外顯子及9個(gè)內(nèi)含子[11-13]。PRR11基因位于17q23擴(kuò)增區(qū)，該區(qū)拷貝數(shù)在乳腺癌、肺癌、腦瘤及卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞中顯著增加，且其擴(kuò)增程度與上述腫瘤的發(fā)展、擴(kuò)散及預(yù)后相關(guān)[14-15]。目前發(fā)現(xiàn)多個(gè)腫瘤相關(guān)基因也位于該區(qū)域，如RPS6KB1、BRIP1、TRIM37、PPM1D等[16-17]。

PRR11基因編碼蛋白PRR11是一個(gè)富含脯氨酸的蛋白，由360個(gè)氨基酸構(gòu)成，相對(duì)分子量為40 085 Da。該蛋白分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞骨架[18]。該蛋白的作用靶標(biāo)可能為膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、啟動(dòng)子等與腫瘤產(chǎn)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白及基因位點(diǎn)。

PRR11在多種惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、周期進(jìn)程、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，為了初步闡明PRR11表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，我們利用PRR11 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌HGC-27細(xì)胞，采用Western blotting技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染后PRR11表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRR11-KD細(xì)胞組中PRR11表達(dá)顯著低于PRR11-NC細(xì)胞組，提示PRR11 shRNA顯著下調(diào)HGC-27細(xì)胞中PRR11表達(dá)，為深入研究PRR11在HGC-27細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。我們采用CCK-8試劑盒檢測(cè)PRR11-KD細(xì)胞與PRR11-NC細(xì)胞增殖的差異，結(jié)果顯示，PRR11-KD細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制，提示下調(diào)PRR11表達(dá)導(dǎo)致HGC-27細(xì)胞增殖能力下降。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRR11-KD細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著低于PRR11-NC細(xì)胞(P<0.05)，提示PRR11表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致HGC-27細(xì)胞侵襲能力下降。為進(jìn)一步探討上述變化的分子機(jī)制，我們采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)了PRR11-KD細(xì)胞及PRR11-NC細(xì)胞中增殖及侵襲相關(guān)蛋白(cyclinD1和MMP-2)表達(dá)的狀況，結(jié)果顯示，PRR11表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致cyclinD1蛋白及MMP-2蛋白表達(dá)降低，提示PRR11表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的HGC-27細(xì)胞侵襲能力下降可能與cyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)下降相關(guān)。

綜上所述，PRR11表達(dá)下調(diào)顯著抑制HGC-27細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其介導(dǎo)的增殖與侵襲能力下降可能與cyclin D1和MMP-2表達(dá)下降密切相關(guān)，深入研究PRR11的作用機(jī)制，有望為解釋胃癌的發(fā)生與發(fā)展提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：馬軍)

Knockdown of PRR11 expression inhibits proliferation and invasion in gastric cancer HGC-27 cells

SONG Zongchang, GUO Changsheng, ZHAO Pengfei, TANG Jiahong, HAN Huaizhong, ZHANG Lixin, SHEN Liqun, GUO Chunliang, YUE Rongxi

Department of Oncology, the 155th Central Hospital of PLA/The Key Laboratory for Hematology of Kaifeng, Kaifeng 475003, China

Objective To investigate the influence of PRR11 expression on proliferation and invasion in gastric cancer HGC-27 cells, and to investigate its possible molecular mechanisms.Methods PRR11 shRNA and empty vector lentivirus were transfected into gastric cancer HGC-27 cells, which was divided into two groups. Expression of PRR11 in gastric cancer HGC-27 cells was detected by Western blotting after transfection. Subsequently, cell proliferation and cell invasion were detected by CCK-8 kit and transwell chambers, respectively. Finally, Western blotting was used to study expressions of cyclin D1 and MMP-2 proteins in two gastric cancer cells. Results PRR11 shRNA effectively down-regulated the expression of PRR11 in gastric cancer HGC-27 cells. Additionally, knockdown the expression of PRR11 led to the proliferation inhibition and the decrease of invasion in gastric cancer HGC-27 cells, accompanied by the down-regulation of cyclinD1 and MMP-2 proteins.Conclusion Knockdown of PRR11 expression results in proliferation and invasion inhibition in gastric cancer cells may be closely related to the decrease of expressions of cyclinD1 and MMP-2 proteins.

Gastric cancer; PRR11; Cell proliferation; Cell invasion

河南省開封市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(1407009)

宋宗昌，博士，主治醫(yī)師，研究方向：胃癌診斷與治療。E-mail: szc122@163.com

岳榮喜，碩士，主任醫(yī)師，院長(zhǎng)，研究方向：消化道腫瘤診斷與治療。E-mail: szc_155@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.004

R735.2

A

1006-5709(2016)11-1221-04

2016-08-01