馬大驊姜夢(mèng)迪管藝貝徐菲菲黃 楷劉 悅丁之德

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系（上海 200025）

RNASET2過表達(dá)對(duì)人前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

馬大驊△姜夢(mèng)迪△管藝貝△徐菲菲△黃 楷△劉 悅**丁之德**

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系（上海 200025）

目的研究RNASET2在前列腺腫瘤內(nèi)的表達(dá)情況及其過表達(dá)對(duì)人前列腺腫瘤細(xì)胞系DU145細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法通過Western blot及免疫組化檢測(cè)RNASET2蛋白在人前列腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況；通過慢病毒轉(zhuǎn)染方法在DU145細(xì)胞中過表達(dá)RNASET2，以Quantitive realtime PCR、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；通過CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力；通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲力；通過微絲染色檢測(cè)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果（1）RNASET2在人前列腺腫瘤組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織；（2）DU145細(xì)胞過表達(dá)RNASET2后，細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞遷移及侵襲力下降，細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞微絲骨架顯著變化。結(jié)論RNASET2可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，與肌動(dòng)蛋白結(jié)合可能是其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵。

核糖核酸酶類; 前列腺腫瘤; 細(xì)胞運(yùn)動(dòng); 腫瘤侵潤

核糖核酸酶（Ribonuclease，簡寫為RNase）是一類核酸水解酶，其中能利用2’,3’-環(huán)核苷酸將RNA水解為3’單核苷酸的一類核糖核苷酶，可根據(jù)分子質(zhì)量分為兩組，RNase T1家族及RNase T2家族，前者分子量較?。?1-12 kDa），后者分子質(zhì)量較大（24-36kDa）[1]。RNase T2廣泛存在于自然界的微生物及動(dòng)植物中，而RNASET2（又稱RNASE6PL、bA514O12.3）是一種存在于人體中的RNase T2酶，由7個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊組成具有Rh/T2/S糖蛋白家族典型的結(jié)構(gòu)，也是人體內(nèi)唯一一個(gè)該家族的胞外核酸酶。該蛋白在人體內(nèi)由RNASET2基因編碼，即一個(gè)定位于6q27，全長約27kb含9個(gè)外顯子的單拷貝基因[2]，該基因同時(shí)也是Ⅱ類腫瘤抑制基因，在原發(fā)性卵巢腫瘤或細(xì)胞系、黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞系及非霍奇金淋巴瘤中RNASET2轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，提示該蛋白低表達(dá)可能促進(jìn)多種實(shí)體瘤和血液腫瘤的形成[3-5]，另外，還有實(shí)驗(yàn)證實(shí) RNASET2沉默的卵巢癌細(xì)胞系注射裸鼠后會(huì)導(dǎo)致裸鼠體內(nèi)腫瘤發(fā)生，且其抑腫瘤作用與蛋白的酶解作用無關(guān)[6]。ACTBIND是一種黑曲霉（Aspergillus niger B1）產(chǎn)生的胞外RNase T2，能與actin蛋白結(jié)合并干擾細(xì)胞骨架構(gòu)建，而RNASET2是人體中該蛋白的同源體，提示RNASETS可能具有抑制癌癥細(xì)胞侵襲和抗腫瘤血管生成的作用[7]。

前列腺癌（prostatic cancer，PCa）是一種男性生殖系最常見的惡性腫瘤。隨著我國人口老齡化比例的升高，生活方式的改變，PCa在中國的發(fā)病率也在逐年上升[8]，據(jù)2014年中國腫瘤登記年報(bào)顯示，前列腺癌已升至中國男性泌尿腫瘤死亡率第一位，且該腫瘤的臨床治療效果亟待提高。因此，尋找一種臨床有效的治療前列腺腫瘤的新方法迫在眉睫。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)RNASET2在前列腺癌旁正常組織中的表達(dá)顯著高于癌組織，但目前未有報(bào)道揭示RNASET2對(duì)前列腺腫瘤的抑制作用及其機(jī)制。我們應(yīng)用前列腺癌細(xì)胞系DU145細(xì)胞，通過慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)RNASET2蛋白，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移率等癌細(xì)胞生物學(xué)行為參數(shù)的變化，進(jìn)一步研究RNASET2對(duì)前列腺腫瘤發(fā)生及侵襲過程的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145（購自復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心）, 前列腺癌臨床病理組織和癌旁組織（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院和復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理中心提供，各7例），人RNASET2過表達(dá)慢病毒（購自上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司慢病毒表達(dá)文庫）。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

Trizol（Ambion），逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green PCR Master Mix（Takara），免疫組化試劑盒（Invitrogen），正常小鼠/兔IgG（Yeasen），小鼠抗RNase T2抗體（Santacruze），兔抗actin抗體（CST），HRP標(biāo)記山羊抗兔/小鼠二抗（Jackson ImmunoResearch），鬼筆環(huán)肽羅丹明（Invitrogen），CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（Dojindo），RIPM 1640培養(yǎng)液（Hyclone），RIPA細(xì)胞裂解液（Pierce）。

（二）儀器

紫外/可見分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer），PTC-200 PCR 儀（MJ Research），激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss LSM-510）。

三、方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)和RNASET2過表達(dá)

人前列腺癌細(xì)胞DU145以RIPM1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞密度達(dá)30%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染細(xì)胞（MOI=20），48h后用于實(shí)驗(yàn)。

（二）蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)

前列腺癌臨床病理組織和癌旁組織（7例）在RIPA裂解液中以玻璃勻漿器研磨提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度后分裝置于-80℃保存待用。

吸取上述組織蛋白各約30μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，實(shí)驗(yàn)組加入小鼠抗RNASET2單克隆抗體（1:4000稀釋），對(duì)照組加入正常小鼠IgG（1:4000），4℃過夜，次日TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000，羊抗鼠）室溫再孵育1 h，TBST洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色、成像。

（三）免疫組化檢測(cè)

前列腺癌組織和癌旁組織（7例）經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片。組織切片脫臘，水化，洗滌。 3% H2O2孵育10 min。檸檬酸抗原修復(fù)液中，微波加熱抗原修復(fù)。免疫組化染色按試劑盒說明書操作。小鼠抗RNASET2多克隆抗體（1:200稀釋）為一抗。顯色后，以蘇木精襯染細(xì)胞核。常規(guī)脫水，透明，封片后鏡檢。

（四）熒光定量PCR檢測(cè)

運(yùn)用PRIMER PREMIER 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物5’-GCGGATCCCCCGATAAAAGTGAAG GA-3’，下游引物5’-GCAAGCTTAGGTGGGGGAT AGAAGAC-3’。目的片段長169bp。

細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green染色法進(jìn)行熒光定量PCR分析，檢測(cè)RNASET2基因表達(dá)情況, 反應(yīng)條件如下：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s循環(huán)40次。通過測(cè)定Ct值表示目的基因mRNA的表達(dá)量，以2-△△Ct法（Livak法）顯示基因表達(dá)的相對(duì)變化分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（五）細(xì)胞活力檢測(cè)

采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，每500μL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5μL CCK-8試劑，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育60min，吸取200μL培養(yǎng)液置于96孔酶標(biāo)板中，檢測(cè)A490吸光值，從而判斷細(xì)胞活力。

（六）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

用記號(hào)筆在6孔板背后均勻劃橫線，每隔0.5~1cm一道，每孔至少穿過5條線。每孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，可鋪滿過夜。次日用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，PBS洗3次，加入無血清培養(yǎng)基，37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后取樣，拍照。

（七）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Transwell法）

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞分別消化、分離為各自的單細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞，以無血清RIPM1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL。向Transwell小室每孔均加入100μL細(xì)胞懸液，并在室中加入500μL含有10%FBS完全培養(yǎng)基，37℃孵育12h后4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，洗滌后擦去上表面細(xì)胞，觀察拍照。

（八）細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell法）

對(duì)Transwell小室進(jìn)行鋪膠處理：無血清培養(yǎng)基和Matrigel按3:1混合，加入小室，37℃孵育1~2h。

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞分別消化、分離為各自的單細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞，以無血清RIPM1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。每孔均加入100μL細(xì)胞懸液，并在室中加入500μL含有10%FBS完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，洗滌后擦去上表面細(xì)胞，觀察拍照。

（九）鬼筆環(huán)肽熒光素微絲染色

細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30min，0.2%Triton破膜10min，鬼筆環(huán)肽（用PBS 1:200稀釋）室溫避光孵育1h，PBS洗3次，DAPI（1:1000）3min染色細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

（十）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件（Chicago，IL）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、檢測(cè)前列腺癌組織與癌旁組織中RNASET2的表達(dá)

通過Western blot及免疫組化染色檢測(cè)前列腺癌旁正常組織和前列腺癌組織中的RNASET2蛋白表達(dá)（圖1A，圖1B）。結(jié)果均顯示：前列腺癌組RNASET2表達(dá)較癌旁組織明顯降低。

二、慢病毒轉(zhuǎn)染DU145后RNASET2的轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)

六孔板培養(yǎng)細(xì)胞至密度達(dá)30%后，將包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過共聚焦顯微鏡檢測(cè)GFP熒光信號(hào)觀察，可見視野中充滿轉(zhuǎn)染成功的表達(dá)綠色熒光的DU145細(xì)胞（圖2A）。

慢病毒轉(zhuǎn)染48h、72h后分別通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)RNASET2的表達(dá)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48h后RNASET2的表達(dá)量為對(duì)照組的2倍以上，轉(zhuǎn)染72h后RNASET2的表達(dá)量為對(duì)照組的2.5倍左右（圖2B）。需要說明的是，由于過表達(dá)RNASET2后，細(xì)胞狀態(tài)不佳，部分細(xì)胞死亡。因此，雖然細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很高，但檢測(cè)到細(xì)胞中RNASET2過表達(dá)水平并不是特別高。

三、RNASET2過表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞活力的影響

通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力（A450：1.3±0.2）相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞活力（A450：3.0±0.2）顯著下降（P＜0.01）（圖2C）。

四、RNASET2對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲力的影響

（一）RNASET2對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲力影響

RNASET2過表達(dá)的DU145細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)中遷移距離較對(duì)照組明顯減小[（746.44±39.04） μm vs（821.85±18.99）μm， P＜0.05]（圖3），在遷移實(shí)驗(yàn)中穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)也少于對(duì)照組[（217.60±60.02）個(gè) vs（408.00±34.45）個(gè)，P＜0.05]（圖4），同時(shí)在侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過Matrigel膠和聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組也明顯減少（24.33±11.02 個(gè)vs 58.33±4.04個(gè)，P＜0.05）（圖4），表明RNASET2可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲力。

圖1 前列腺癌組織與癌旁組織中RNASET2的表達(dá)

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后DU145細(xì)胞中RNASET2的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞活力的影響

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移力和侵襲力

（二）RNASET2對(duì)前列腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)DU145細(xì)胞進(jìn)行RNASET2過表達(dá)（慢病毒轉(zhuǎn)染）處理，后利用鬼筆環(huán)肽熒光素進(jìn)行微絲染色。結(jié)果顯示：相比對(duì)照組未處理細(xì)胞，RNASET2過表達(dá)處理后細(xì)胞形態(tài)有收縮變圓的趨勢(shì)，細(xì)胞內(nèi)部微絲纖維結(jié)構(gòu)消失，即過表達(dá)處理可能影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力（圖5）。

討 論

前列腺癌是一種男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。多年來，針對(duì)該腫瘤的研究和實(shí)驗(yàn)層出不窮。RNASET2基因廣泛存在于動(dòng)植物及微生物細(xì)胞中，其編碼的蛋白是人體Rh/T2/S糖蛋白家族唯一的胞外核酸水解酶，在胞外pH為5時(shí)可催化多聚核苷酸的水解。該基因同時(shí)也是Ⅱ類腫瘤抑制基因，在裸鼠體內(nèi)人為抑制RNASET2的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)卵巢癌的發(fā)生[6]，同時(shí)，有研究表明[9]，向培養(yǎng)液中加入RNASET2蛋白后，黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲受到抑制。然而，對(duì)前列腺腫瘤目前國內(nèi)外還未見實(shí)驗(yàn)揭示RNASET2對(duì)該腫瘤的發(fā)生、遷移和侵襲影響等腫瘤生物學(xué)行為的研究報(bào)道。

圖5 RNASET2過表達(dá)后對(duì)DU45細(xì)胞微絲的影響

在本實(shí)驗(yàn)前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，RNASET2在前列腺癌旁正常組織中表達(dá)顯著高于腫瘤組織，同時(shí)，相比正常細(xì)胞，RNASET2基因過表達(dá)的DU145細(xì)胞其活力明顯降低，提示該基因?qū)η傲邢倌[瘤具有一定的抑制作用。

A C T I B I N D是一種從黑曲霉菌中提取的RNASET2，能與在體內(nèi)和細(xì)胞表面的actin有效結(jié)合，共同形成一個(gè)氫鍵網(wǎng)絡(luò)[10]， 阻斷細(xì)胞的遷移。人RNASET2與ACTIBIND功能類似，Nesiel-Nuttman[11]等發(fā)現(xiàn)RNASET2蛋白的第135-141個(gè)殘基所形成的肽段對(duì)其與actin的結(jié)合具有重要意義。因此，RNASET2很可能通過同樣的方式影響前列腺腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程。

本項(xiàng)研究的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，RNASET2過表達(dá)的DU145細(xì)胞其遷移和侵襲力均明顯降低，且用鬼筆環(huán)肽熒光素進(jìn)行微絲染色后觀察到腫瘤細(xì)胞形態(tài)收縮變圓，細(xì)胞內(nèi)部微絲纖維結(jié)構(gòu)消失，提示前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)的RNASET2通過與肌動(dòng)蛋白作用以抑制其侵襲和遷移過程。

總之，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及RNASET2在大腸癌、卵巢癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中的研究[3,6,12,13]可以發(fā)現(xiàn)，RNASET2在前列腺腫瘤治療如抑制癌癥進(jìn)展、侵襲等方面有較為廣闊的應(yīng)用前景。如一些RNASET2功能性小片段可以作為生物制劑進(jìn)行應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)trT2-50（只保留了結(jié)合actin功能的RNASET2片段）在抑制血管生成、克隆集落生成和腫瘤進(jìn)展方面有較為顯著的效應(yīng)[14]；另外，由于RNASET2作為一種分泌性糖蛋白，多項(xiàng)研究也表明在腫瘤微環(huán)境中其會(huì)發(fā)揮更為明顯的作用。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將構(gòu)建裸鼠動(dòng)物人前列腺癌種植模型，進(jìn)一步觀察RNASET2對(duì)于活體小鼠人前列腺移植瘤的影響，這也為今后臨床上研究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的病理機(jī)制以及前列腺癌診治新方法的探索提供重要的理論基礎(chǔ)和充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2016-09-08收稿）

The effects of RNASET2 over-expression on biological behaviors of human prostate cancer cells*

Ma Dahua△, Jiang Mengdi△, Guan Yibei△, Xu Feifei△, Huang Kai△, Liu Yue**, Ding Zhide**
1. Department of Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China

Liu Yue, E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn; Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

ObjetiveTo analysis the expression of RNASET2 in prostate tumor cells and explore its effect on DU145 cell biological behaviours, including cell viability, migration and invasion.MethodsThe expressions of RNASET2 in human prostate cancer and peri-cancer tissue were measured by Western blot and immunohistochemistry. The fuorescence confocal microscopy and quantitive realtime PCR were used to test the expression level of RNASET2 in DU145 cell transfected by lentivirus. The effect of RNASET2 on post-transfection cell viability was analyzed by CCK-8, and tumor cell migration and invasion were detected by wound healing test and Transwell test individually. Finally, the cytoskeletal structure change was observed by staining of microflament.Results(1) The expression level of RNASET2 in human prostate cancer tissue was signifcantly lower than that in peri-cancer tissue. (2) Over-expressing RNASET2 in DU145 cell showed a signifcant decrease in cell viability, migration and invasion as well as morphological and cytoskeletal structure changes.ConclusionRNASET2 may play a vital role in the development of prostate cancer and actin-binding may be the key factor in its inhibitory effect on cancer cell migration and invasion.

Ribonucleases; prostatic neoplasms; cell Movement; neoplasm invasiveness

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.002

R 737.25

資助：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第八期大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（2014010）

**共同通訊作者：劉悅，E-mail: liuyue@shsmu.edu.cn；丁之德，E-mail: zding@shsmu.edu.cn

△為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系12級(jí)八年制