郭麗媛 孫筱放 周 華 袁靜茹 劉 敏

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510150）

全自動(dòng)精漿果糖檢測(cè)方法的建立及主要性能評(píng)價(jià)*

郭麗媛 孫筱放 周 華 袁靜茹 劉 敏

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科研究所，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510150）

目的建立全自動(dòng)精漿果糖檢測(cè)方法并對(duì)其準(zhǔn)確度、精密度及線性范圍等進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法在全自動(dòng)特定蛋白分析儀上利用己糖激酶法檢測(cè)精漿果糖，評(píng)估該方法的準(zhǔn)確度、精密度及線性范圍，并與臨床上常用的吲哚顯色法進(jìn)行比較。結(jié)果果糖質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果在其定值范圍內(nèi)?；厥赵囼?yàn)結(jié)果獲得回收率分別為96.15% 和103.37%。全自動(dòng)己糖激酶法測(cè)定精漿果糖精密度高，批內(nèi)精密度與批間精密度的CV值分別為0.63%和1.27%。精漿果糖濃度在0.065~4.16mmol/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系（r2= 1.00）。分別采用吲哚顯色法與全自動(dòng)己糖激酶法檢測(cè)105個(gè)精漿標(biāo)本的果糖濃度，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果因其方法學(xué)不同而存在差異（P＜0.01），但兩種方法的檢測(cè)結(jié)果呈顯著正相關(guān)（r2=0.96 ，P＜0.01），線性回歸方程為：y= 1.19x+1.67 （R2=0.93，P＜0.01）。結(jié)論本研究建立的全自動(dòng)精漿果糖檢測(cè)法具有良好的準(zhǔn)確度與精密度，與臨床常用方法有較好的相關(guān)性。該法操作簡(jiǎn)單，安全快速，更適用于臨床大批量樣本的檢測(cè)，建議在男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室推廣。

精液; 果糖; 己糖激酶

精漿果糖由精囊腺分泌，是精子活動(dòng)的主要能量來(lái)源，直接參與精子獲能和授精。精子軸絲收縮依賴ATP供給能量，而ATP可由果糖分解代謝產(chǎn)生，因此精漿果糖濃度減低將使精子活動(dòng)力減弱，影響受精率。精子運(yùn)動(dòng)與果糖酵解成正相關(guān)，果糖分解率越高，精子活動(dòng)也越強(qiáng)，所以精漿果糖含量與男性生育力密切相關(guān)[1]。有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，精漿果糖與精子密度呈顯著負(fù)相關(guān)[2-4]。而精液中低果糖濃度是射精管阻塞、雙側(cè)輸精管先天性缺如、不完全逆行射精和雄激素缺乏的特征[5]。Buckett等首次報(bào)道非阻塞性無(wú)精子癥患者精漿中果糖濃度升高[6]，測(cè)定精漿果糖含量將有助于輔助診斷阻塞性無(wú)精子癥和非阻塞性無(wú)精子癥。

目前，用于檢測(cè)精漿果糖的方法有氣相層析法、間苯二酚顯色法和吲哚顯色法等多種方法[7]。大多數(shù)關(guān)于精漿果糖的文獻(xiàn)報(bào)道基本以間苯二酚法[2,8,9]和吲哚顯色法[4,10]為主，并且 吲哚顯色法為WHO推薦方法[5]，但是這兩種方法的操作程序都較繁瑣，標(biāo)本前期需要去蛋白處理且實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要濃鹽酸參與反應(yīng)。隨著臨床標(biāo)本量日益遞增，臨床上需要更方便快捷的方法來(lái)提高檢測(cè)效率，全自動(dòng)檢測(cè)是一種必然的發(fā)展趨勢(shì)。

因此，本研究從臨床實(shí)際出發(fā)，以己糖激酶法為基礎(chǔ)建立了全自動(dòng)精漿果糖的定量檢測(cè)方法并對(duì)其進(jìn)行主要的性能評(píng)價(jià)。

材料與方法

一、試劑與儀器

（一）主要試劑

果糖測(cè)定試劑盒（己糖激酶法）（重慶博士泰生物技術(shù)有限公司），包括：R1試劑，主要由PIPES，NADP+，己糖激酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和疊氮鈉組成；R2試劑，ATP ，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和疊氮鈉組成；4.16mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液。精漿果糖定量檢測(cè)試劑盒（吲哚顯色法）（按照WHO第五版[5]標(biāo)準(zhǔn)自行配制）。果糖質(zhì)控品（定值范圍6.49~9.38mmol/L，BioSystems）

（二） 主要儀器

A 1 5全自動(dòng)特定蛋白分析儀（西班牙BioSystems）。

二、 檢測(cè)原理

D-果糖與ATP在己糖激酶的催化下生成果糖-6-磷酸及ADP，果糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化下生成葡萄糖-6-磷酸，后者與NADP+在G-6-PDH的作用下生成葡萄糖酸-6-磷酸+NADPH+H+。樣本中的果糖含量與酶促反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度的變化值成正比，通過(guò)測(cè)定340nm波長(zhǎng)處NADPH上升的吸光度值即可計(jì)算出果糖的濃度。

三、檢測(cè)方法

（一） 具體步驟

受試者禁欲2~7d，通過(guò)手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液標(biāo)本，記錄精液樣本的總體積，精液液化混勻后，取部分標(biāo)本以3 000×g，離心15min后留取上層精漿。取200μL精漿與800μL純水混勻后直接上機(jī)檢測(cè)。

（二） 基本參數(shù)

主波長(zhǎng)：340nm；副波長(zhǎng)：（670±10）nm；反應(yīng)溫度：37℃；反應(yīng)時(shí)間：6min；樣本/試劑R1/試劑R2：1/20/5；分析方法：終點(diǎn)法。

四、準(zhǔn)確度測(cè)定

（一）質(zhì)控品檢測(cè)

果糖質(zhì)控品隨精漿標(biāo)本上機(jī)檢測(cè)。

（二）回收試驗(yàn)

選取2份精漿標(biāo)本作為基礎(chǔ)樣本，4.16mmol/L的果糖標(biāo)準(zhǔn)液作為回收樣本，計(jì)算各自的回收率。

五、精密度測(cè)定

取凍存的混合精漿，采用全自動(dòng)己糖激酶法一批內(nèi)連續(xù)檢測(cè)20次，分別計(jì)算出均值和標(biāo)準(zhǔn)差，得出批內(nèi)變異系數(shù)（CV）；取果糖標(biāo)準(zhǔn)液，連續(xù)測(cè)定20d，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，得出批間變異系數(shù)（CV）。

六、線性分析

將4.16mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液加純水稀釋，得到另外6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液：2.08，1.04, 0.52, 0.26, 0.13, 0.065mmol/L，使用儀器自動(dòng)檢測(cè)獲得結(jié)果，以理論值與實(shí)際測(cè)定值繪制相關(guān)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。

七、方法學(xué)比較

選取105個(gè)不育男性的精漿標(biāo)本，標(biāo)本來(lái)源于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦研所實(shí)驗(yàn)部男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室，其中無(wú)精子癥10例，少精子癥24例，正常精子濃度71例。3 000×g，離心15min后留取上層精漿，分別利用全自動(dòng)己糖激酶法與吲哚顯色法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按各自的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)兩種方法學(xué)比較結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)性分析及線性回歸分析，采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行線性相關(guān)與回歸作圖，以P＜0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、準(zhǔn)確度檢測(cè)

（一）質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果

果糖質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果在定值范圍（6.49~9.38mmol/L）內(nèi)。

（二）回收試驗(yàn)

采用全自動(dòng)己糖激酶法檢測(cè)2份精漿樣本的基礎(chǔ)管，測(cè)得的果糖濃度分別為3.56mmol/L和0.80mmol/ L, 相應(yīng)測(cè)定管的濃度為3.96mmol/L和1.23mmol/L。計(jì)算獲得該方法的回收率分別為96.15% 與103.37%。

二、精密度檢測(cè)

批內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果為（8.46±0.05）mmol/L，CV值為0.63%；批間精密度檢測(cè)結(jié)果為（4.20±0.05）mmol/L，CV值為1.27%。

三、線性分析

結(jié)果顯示：果糖濃度在0.065~4.16mmol/L范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系（r2=1.00），見(jiàn)圖1。

圖1 果糖濃度檢測(cè)的線性分析

四、方法學(xué)比較

以吲哚顯色法為對(duì)照方法，全自動(dòng)己糖激酶法為試驗(yàn)方法，兩者檢測(cè)105個(gè)精漿標(biāo)本的果糖濃度結(jié)果分別為（37.74±32.17 ）mmol/L與（ 46.72±39.83）mmol/L。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果存在差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Pearson相關(guān)性分析顯示，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果呈顯著正相關(guān)（r=0.96 ），相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。將兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，得出的線性回歸方程為y=1.19x+1.67（R2=0.93 ，P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 線性回歸擬合圖

討 論

精漿果糖是精漿生化中的一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)于不育癥的診治具有重要意義。目前，精漿果糖檢測(cè)已在臨床上廣泛開(kāi)展。WHO推薦的精漿果糖定量檢測(cè)方法為吲哚顯色法，然而這種方法學(xué)存在以下不足之處：（1）反應(yīng)特異性不夠理想；（2）在濃鹽酸環(huán)境下反應(yīng)， 由于濃鹽酸易揮發(fā)，易造成反應(yīng)重復(fù)性差，尤其是標(biāo)本檢測(cè)量大時(shí)，由于操作時(shí)間的延長(zhǎng)，這種現(xiàn)象更為明顯；（3）生物安全性差，強(qiáng)酸易污染環(huán)境及易腐蝕儀器[11]。

為了滿足臨床大批量標(biāo)本的檢測(cè)，本研究采用己糖激酶法在全自動(dòng)特定蛋白分析儀上開(kāi)展精漿果糖的測(cè)定，其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，果糖質(zhì)控品的檢測(cè)值在其定值范圍內(nèi)?；厥赵囼?yàn)的結(jié)果顯示2份精漿樣本的回收率分別為96.15% 與103.37%，均在允許的范圍之內(nèi)（95%~105%）。 批內(nèi)精密度檢測(cè)CV值為0.63%，批間精密度檢測(cè)CV值為1.27%，能滿足臨床要求。精漿果糖濃度在0.065~4.16mmol/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r2=1.00）。

在方法學(xué)對(duì)比試驗(yàn)中，我們選擇了105個(gè)不育男性的精漿標(biāo)本進(jìn)行吲哚顯色法和全自動(dòng)己糖激酶法的平行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果可能因?yàn)榉椒▽W(xué)的不同而存在差異，這與何小紅等[11]先前的報(bào)道結(jié)果相似，但這并不影響精漿果糖（己糖激酶法）在臨床中的應(yīng)用。而本文研究的全自動(dòng)己糖激酶法與吲哚顯色法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的相關(guān)性（r2=0.96），并且通過(guò)線性回歸分析獲得線性回歸方程為y=1.19x+1.67（R2=0.93）。

與吲哚顯色法比較，全自動(dòng)己糖激酶法無(wú)需進(jìn)行反應(yīng)前的去蛋白處理，亦無(wú)需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加濃鹽酸參與反應(yīng)，這將大大的簡(jiǎn)化了操作流程及提高了實(shí)驗(yàn)的安全性與穩(wěn)定性。在反應(yīng)時(shí)間上，吲哚顯色法至少需要55min，而全自動(dòng)己糖激酶法的反應(yīng)時(shí)間是6min，可見(jiàn)全自動(dòng)己糖激酶法具有更高的檢測(cè)效率，更能滿足大批量標(biāo)本的檢測(cè)需求。既往研究報(bào)道，己糖激酶法是理想的方法學(xué)，除了試劑價(jià)格相對(duì)較高之外，具有吲哚顯色法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，是精漿果糖檢測(cè)方法學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)[11]。而陸金春等[12]建立了另外一種全自動(dòng)檢測(cè)法——精漿果糖速率法，并從多方面證明其實(shí)用性，但該法與吲哚顯色法的相關(guān)性（r2=0.94）不如本研究中建立的全自動(dòng)己糖激酶法（r2=0.96）。

總之，本研究將己糖激酶法與全自動(dòng)特定蛋白分析儀相結(jié)合而建立起來(lái)的全自動(dòng)精漿果糖檢測(cè)方法，既具有酶法的優(yōu)點(diǎn)，又有全自動(dòng)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，能更好的滿足臨床需求，有希望在男性學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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11 何小紅, 劉瑜. 精漿果糖定量檢測(cè)試劑盒性能評(píng)價(jià). 中國(guó)男科學(xué)雜志 2005; 19(5): 51-53

12 陸金春, 盧坤剛, 張紅燁, 等. 精漿果糖速率檢測(cè)法的初步評(píng)價(jià). 臨床檢驗(yàn)雜志 2015; 33(1): 6-8

（2016-08-28收稿）

Performance evaluation and establishment of an automatic assay on seminal fructose level

Guo Liyuan, Sun Xiaofang, Zhou Hua, Yuan Jingru, Liu Min
Institute of Obstetrics and Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Key Lab of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institute, Guangzhou 510150, China

ObjectiveTo establish an automatic assay for seminal fructose level and evaluate its accuracy, precision and linear range.MethodsThe concentration of seminal fructose was measured by hexokinase method on an automatic specifc protein analyzer, and the accuracy, precision and linear range of this method were evaluated , and the results of this method were compared with those of indole chromogenic method commonly used in clinical.ResultsThe result of the fructose quality control determined by the automatic method falls within the scope of value. The recovery rates of the recovery experiment were 96.15% and 103.37%. The automatic method had excellent within-run and between-run precision, and the coeffcients of variation (CV) were 0.63% and 1.27%, respectively. A good linear relationship (r2= 1.00) was shown when the concentration of seminal fructose was between 0.065 and 4.16 mmol /L. Compared with the results of indole chromogenic method , the results of automatic method showed statistical difference (P<0.01) because of different methodologies. But it had a signifcant positive correlation between the results of seminal fructose concentration from 105 seminal samples analyzed by indole chromogenic and automatic method (r2=0.96 ，P<0.01). The linear regression equation: y= 1.19x+1.67 (R2=0.93 ，P<0.01).ConclusionThe established automatic method for analysis of seminal fructose level has good accuracy and precision, and it also has good correlation with the commonly used method in clinical. The operation of this method established in our study is simple, safe and fast. It would be more suitable for analyzing large numbers of samples and it could be applied to andrology laboratory.

semen; Fructose; Hexokinase

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.008

R 446.144

資助：廣州醫(yī)科大學(xué)青年基金（2013A20）