汪玉梅, 蘇賢君, 符 崖, 王志芳, 張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

金櫻根化學成分研究(Ⅰ)*

汪玉梅, 蘇賢君, 符 崖, 王志芳, 張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006)

前期研究表明廣東涼茶顆粒中三萜皂苷主要來源于崗梅和金櫻根。而目前對于金櫻根化學成分研究主要集中在金櫻子葉和果實，對其根化學成分研究鮮見報道?；诖耍搶嶒炘谇捌诨A(chǔ)上采用正反相硅膠、凝膠等多種分離手段對金櫻根甲醇提取物的乙酸乙酯相化學成分進行研究，從中分離得到了6個化合物，采用現(xiàn)代波譜分析和文獻對照等方法鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：2α, 3α, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、2α, 3β, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、2α, 3β, 19α, 23-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、齊墩果酸(4)、熊果酸(5)、(+)-兒茶素(6)?；衔?，2，3為首次從金櫻根中分離得到，且為廣東涼茶顆粒中三萜皂苷類成分。

金櫻根；化學成分；三萜及其苷類；結(jié)構(gòu)鑒定

金櫻根為薔薇科薔薇屬植物金櫻子RosalaevigataMichx.的根或根莖，其性平，味酸、澀，歸脾、肝、腎經(jīng)。具有收斂固澀、止血斂瘡、祛風活血、止痛、殺蟲等作用[1]。現(xiàn)今金櫻根是國家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)——廣東涼茶顆粒(王老吉)的主要原料之一，前期研究表明廣東涼茶顆粒中三萜皂苷主要來源于崗梅和金櫻根[2-4]，崗梅中三萜皂苷類成分主要含有磺酸基，而金櫻根則以熊果烷及齊墩果烷型的五環(huán)三萜為主。對于金櫻根的文獻調(diào)研表明[5]，目前主要集中在金櫻子葉和果實的化學成分[6-8]，而對其根化學成分的研究主要是鞣質(zhì)類成分[9]?；诖?，本實驗在前期基礎(chǔ)[10-12]上采用正反相硅膠、凝膠等多種分離技術(shù)對金櫻根甲醇提取物的乙酸乙酯相進行了系統(tǒng)研究，從中分離得到了6個化合物，采用文獻對照以及現(xiàn)代波譜分析方法確定其結(jié)構(gòu)分別為：2α, 3α, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、2α, 3β, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、2α, 3β, 19α, 23-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、齊墩果酸(4)、熊果酸(5)、(+)-兒茶素(6)。化合物1，2，3為首次從金櫻根中分離得到，且為廣東涼茶顆粒中三萜皂苷類成分。

圖1 從金櫻根乙酸乙酯相中分離得到的6個化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Six structures of compounds 1，2，3，4，5，6 from the roots of Rosa laevigata Michx

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器：北京泰克光學儀器廠X-6型熔點儀(熔點未矯正)；旋光由德國POLARTRONIC H H W5 polarimeter (SCHMIDT+ HAENSCH，Germany) 測定；AVANCE AV 600 MHz、400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Finnigan公司LCQDECAXP)；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器RE-5299(鞏義市予華儀器有限責任公司)；SHD-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；MODEL NH1006超聲儀(中國華南超聲設(shè)備廠)；電子分析天平(AUY120，廣州湘儀機電設(shè)備有限公司)；ODS為日本YMC公司產(chǎn)品(50 μm)；凝膠為Sephadex LH-20(日本YMC)；柱層析硅膠(200～300目)為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。

HPLC-MSn用試劑：甲醇、水為色譜純(美國Sigma公司)實驗用水為超純水，由超純水設(shè)備制備(美國Milipore公司)；分離用溶劑：石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等試劑均為廣州化學試劑廠產(chǎn)品(分析純)。

材料：金櫻根(產(chǎn)地：湖南；生產(chǎn)批號：110801；廣州致信中藥飲片有限公司)。

1.2 提取與分離

金櫻根(15 kg)，經(jīng)φ=80%甲醇/水浸漉提取，減壓回收甲醇，濃縮后得浸膏(2.306 kg)。浸膏用蒸餾水捏溶，依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，萃取液減壓濃縮得PE相(2 g)，EtOAc相(621.3 g)，n-BuOH相(682.0 g)和 H2O相(500 g)。

乙酸乙酯部位(621.3 g)進行硅膠(200～300目)柱層析，先以石油醚-乙酸乙酯溶劑體系(V(PE)∶V(EtOAc)=9∶1,7∶3,5∶5,3∶7)洗脫，后以乙酸乙酯-甲醇溶劑體系(V(EtOAc)∶V(MeOH)=9∶1, 8∶2,7∶3,5∶5, 3∶7, 0∶1)洗脫，TLC跟蹤，得到16個流分(RL1至RL16)。流分RL-10經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=10∶1)和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=4∶1)得到化合物1(20 mg)；流分RL-10經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=10∶1)，Sephadex LH-20(V(MeOH)∶V(H2O)=9∶1)和硅膠柱層析(V(CHCl3)∶V(EtOAc)∶V(Acetone)=5∶1∶2)得到化合物2(40 mg)；流分RL-13經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=11∶1) 和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=1∶4)得到化合物3(24 mg)；流分RL-9經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=15∶1)，硅膠(200～300目)柱層析(V(CHCl3)∶V(MeOH)=10∶1)和Sephadex LH-20(V(MeOH)∶V(H2O)=9∶1)得到化合物4(5.5 mg)；流分RL-5經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(PE)∶V(EtOAc)=8∶2)和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=3∶2)得到化合物5(30 mg)；流分RL-6經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(V(PE)∶V(EtOAc)=9∶1)和反相C18柱層析(V(MeOH)∶V(H2O)=3∶2)得到化合物6(15 mg)。

1.3 化合物物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物4：白色無定型粉末(MeOH),θmp307～309 ℃, ESI-MSm/z935[2M+Na]+, 479[M+Na]+; NMR(600 MHz, CD3OD)見表1和表2。

化合物5：白色無定型粉末(MeOH),θmp282～284 ℃, ESI-MSm/z935[2M+Na]+, 479[M+Na]+; NMR(600 MHz, CD3OD)見表1和表2。

表1 化合物1,2,3,4,5關(guān)鍵位置1H NMR數(shù)據(jù)

2 結(jié)果與討論

化合物1：白色針狀結(jié)晶(CHCl3-MeOH)，θmp230～232 ℃；φ=5%硫酸乙醇溶液顯藍色斑點，Libermann- Burchard和Molish反應(yīng)均為陽性，暗示結(jié)構(gòu)為皂苷類成分。ESI-MSm/z673 [M+Na]+，結(jié)合1H NMR、13C NMR和DEPT譜( 7個-CH3，9個-CH2，12個-CH和8個-C )確定化合物1分子式為C36H58O10，不飽和度為8。1H NMR共顯示7個-CH3信號峰，分別為δH0.90、1.03、1.20、1.24、1.36、1.60 (各 3H, s)和1.06 (3H, d,J=7.0 Hz)。另外δH5.38 (1H, br. s)及δC138.9(s)和128.0(d)說明化合物1存在1個雙鍵。δC177.5 (s)提示含有羰基碳，除此外無任何不飽和度信息，提示該化合物可能為熊果烷型三萜。δH6.28 (1H, d,J=7.5 Hz)和δC95.7 (d)為一典型酯苷鍵中糖的端基信息，說明1為含有1個糖的皂苷類化合物。同時C-28化學位移值為δC177.5 (s)也暗示其為酯苷鍵。將1進行酸水解，糖的GLC分析結(jié)果表明該化合物所含的糖為β-D-葡萄糖[19]。將1的NMR數(shù)據(jù)(表1和表2)與文獻[10,13]對照基本一致，確定1為2α, 3α, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時采用HPLC-MSn技術(shù)與廣東涼茶顆粒的化學成分進行對比研究，發(fā)現(xiàn)此成分為廣東涼茶顆粒中含有，確定其來源為金櫻根[2-4,10]。

表2 化合物1,2,3,4,5的13C NMR數(shù)據(jù)

化合物2：白色針狀結(jié)晶(MeOH)，θmp219～221 ℃；φ=5%硫酸乙醇溶液顯藍色斑點，Libermann-Burchard和Molish 反應(yīng)均為陽性，暗示結(jié)構(gòu)為皂苷類成分。比較化合物2與1的MS和NMR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)二者基本一致。僅C-3的化學位移值明顯向低場移動5.5外 [2：δC84.4 (d, C-3)；1：δC78.9 (d, C-3)]不同，說明二者為C-3位差異的一對異構(gòu)體。將2的NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與文獻[10, 14]對照基本一致，故確定2為2α, 3β, 19α-三羥基烏蘇-12-烯-28-酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時采用HPLC-MSn技術(shù)與廣東涼茶顆粒的化學成分進行對比研究，發(fā)現(xiàn)此成分為廣東涼茶顆粒中含有，確定其來源為金櫻根[2-4,10]。

化合物3：白色粉末(CHCl3-MeOH)，θmp271～272 ℃，φ=5%硫酸乙醇溶液顯藍色斑點，Libermann-Burchard和Molish 反應(yīng)均為陽性，暗示結(jié)構(gòu)亦為皂苷類成分。ESI-MSm/z: 689 [M+Na]+；結(jié)合NMR(6個-CH3，10個-CH2，12個-CH和8個-C) 確定3分子式為C36H58O11，不飽和度為8。NMR中給出典型熊果烷甲基質(zhì)子信息(δH0.69, 0.76, 1.22, 1.28, 1.35 (各 3H, s)和1.06 (3H, d,J=3.2 Hz))和12,13位三取代雙鍵(δH5.48 (1H, br. s)及δC138.8 (s)和128.9 (d))。同時δH5.35 (1H, d,J=7.0 Hz)和δC96.0 (d)為一典型酯苷鍵中糖的端基信息，說明3也為含有1個糖的三萜皂苷。將3的NMR數(shù)據(jù)與2對照，二者數(shù)據(jù)基本一致，只是少了一個甲基信息[δC29.6 (q, C-23)]而增加了一個羥甲基信息[δC67.1(t, C-23)]。將3的NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與文獻[10,13]對照基本一致，故確定3為2α,3β,19α,23-四羥基烏蘇-12-烯-28-酸 28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。同時采用HPLC-MSn技術(shù)與廣東涼茶顆粒的化學成分進行對比研究，發(fā)現(xiàn)此成分為廣東涼茶顆粒中含有，確定其來源為金櫻根[3-4,6]。

化合物4：白色無定型粉末(MeOH)，θmp307～309 ℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽性，提示該化合物可能為三萜或甾體類化合物。ESI-MS 給出m/z935[2M+Na]+，479[M+Na]+，13C NMR譜可見30個碳信號，結(jié)合相對分子質(zhì)量可推出化合物4的分子式為C30H48O3，不飽和度為7。1H NMR譜高場區(qū)可觀察到7個-CH3信號峰，分別為δH0.74，0.76，0.88，0.91，0.92，0.98，1.13 (均為3H, s)，都為單峰，故推測4為齊墩果烷型母核。NMR中給出4結(jié)構(gòu)中還含有一個三取代雙鍵(δH5.24(1H, t,J=3 Hz)；δC142.2(s), 121.8(d))、一個連氧次甲基(δH3.22(1H, m)；δC78.2(s))和一個羧基(δC181.7(s))。將4的NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與齊墩果酸對照基本一致[15-16]，故確定4為齊墩果酸。

化合物5：白色無定型粉末(MeOH)，θmp282～284 ℃，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽性，提示該化合物可能為三萜或甾體類化合物。ESI-MS 給出m/z935[2M+Na]+，479[M+Na]+，13C NMR譜可見30個碳信號，結(jié)合相對分子質(zhì)量得出5的分子式為C30H48O3，不飽和度為7。1H NMR譜高場區(qū)可觀察到7個-CH3信號峰，分別為δH0.79，0.83，0.94，0.97，1.01，1.11 (均為3H, s)和0.88(3H, d,J=7 Hz)，提示化合物5亦為三萜類化合物，由于存在一個雙重峰的甲基信號，推測是熊果烷型母核。NMR信息提示結(jié)構(gòu)中還存在一個三取代雙鍵(δH5.28(1H, t,J=5 Hz)；δC138.9(s), 126.1(d))，一個連氧次甲基(δH3.23(1H, m)；δC79.5(d))和一個羧基(δC181.4(s))。將其NMR數(shù)據(jù)(表1和2)與熊果酸對照基本一致[17]，故鑒定5為熊果酸。

化合物6：黃色無定型粉末(MeOH)，θmp94～95 ℃，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)和濃硫酸-香草醛均為陽性說明結(jié)構(gòu)中既含有酚羥基又含有飽和醇羥基。結(jié)合ESI-MSm/z289[M-H]-和NMR譜(15個碳：1個-CH2，7個-CH和7個-C)信息，確定6的分子式為C15H14O6，不飽和度為9。1H NMR譜中δH6.84 (1H, d,J=2.0 Hz)，6.72 (1H, dd,J=8.0, 1.6 Hz)和6.76 (1H, d,J=8.0 Hz)顯示其為芳香結(jié)構(gòu)中ABX偶合系統(tǒng)質(zhì)子信息。δH5.93 (1H, d,J=2.0 Hz)和5.86 (1H, d,J=2.0 Hz)為苯環(huán)上間位偶合質(zhì)子信號。δH4.57 (1H, d,J=7.2 Hz)和3.98 (1H, m)為2個飽和連氧碳上的質(zhì)子信號。另外高場區(qū)有一對偕偶質(zhì)子信號：δH2.85 (1H, dd,J=16.0, 5.2 Hz)和2.51 (1H, dd,J=16.0, 8.0 Hz)，說明6為二氫黃酮類化合物。將6的NMR數(shù)據(jù)與(+)-兒茶素對比[18]，二者基本一致，故鑒定化合物6為(+)-兒茶素。

致謝：感謝中山大學分析測試中心關(guān)山越、李瑋、姚俊華、陳曉紅老師等在結(jié)構(gòu)鑒定中給予的支持。

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The chemical constituents from the roots ofRosalaevigataMichx. (Ⅰ)

WANGYumei,SUXianjun,FUYa,WANGZhifang,ZHANGCuixian

(School of Chinese Material Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Previous experiments showed that triterpenoid saponins ofGuangdongLiangchawere mainly from the roots ofilexasprellaandRosalaevigataMichx.. However, chemical constituents mainly focus on leaves and fruits ofRosalaevigataMichx., and the secondary metabolites from the roots ofRosalaevigataMichx. were very few published. So, on the basis of previous study, six compounds were isolated from the roots ofRosalaevigataMichx. by various chromatographic techniques and their structures were identified by spectroscopic analysis and literature confrontation method, such as 2α, 3α, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid β-D- glucopyranosyl ester(1), 2α, 3β, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester (2), 2α, 3β, 19α, 23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester(3), oleanolic acid(4), ursolic acid(5), (+)-catechin(6). Compounds 1，2，3 as triterpenoid saponins in Guangdong Liangcha have been firstly obtained from the roots ofRosalaevigataMichx..

RosalaevigataMichx.; chemical constituents; triterpenoid saponins; structural identification

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.014

2015-10-05

廣東省科技計劃重點資助項目(2010A03010003); 廣東省分析測試技術(shù)公共實驗室開放課題資助項目(001)；2015年高水平大學建設(shè)專項資金資助項目(2050205)

汪玉梅(1978年生),女； 研究方向:方劑配伍規(guī)律；通訊作者: 張翠仙;E-mail:zhangcuixian@aliyun.com

O629.7;R284.2

A

0529-6579(2016)02-0076-06