趙錦慧,何　樂,張　帆,郭　寧,胡利宗,王俊生

(周口師范學院 生命科學與農學學院，河南 周口 466001)

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Ca2+對洋蔥內表皮細胞凋亡的影響

趙錦慧,何樂,張帆,郭寧,胡利宗,王俊生

(周口師范學院 生命科學與農學學院，河南 周口 466001)

摘要：選擇洋蔥為實驗材料，研究不同濃度的Ca2+在不同處理時間下對洋蔥鱗莖內表皮細胞凋亡的影響．結果表明：不同濃度的Ca2+處理洋蔥鱗莖內表皮1 h后就出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，隨著Ca2+濃度的升高及處理時間的延長，細胞凋亡現(xiàn)象更加明顯，細胞凋亡率上升，細胞內丙二醛含量也上升．這表明在一定的Ca2+處理濃度與處理時間作用下，洋蔥鱗莖內表皮細胞形態(tài)、細胞凋亡率及細胞內丙二醛含量均受到不同程度地影響．

關鍵詞：鈣離子；洋蔥鱗莖內表皮細胞；細胞凋亡率；丙二醛含量

洋蔥又叫球蔥、圓蔥、玉蔥、蔥頭、荷蘭蔥，屬于單子葉植物綱、百合目、百合科，原產亞洲西部，中國各地均有種植．洋蔥是人們經常食用的一種蔬菜，它儲存方便、耐運輸、有特殊的香辣味，可增加食欲及預防治療多種疾?。捎谘笫[鱗莖內表皮細胞是成熟的植物細胞，具大液泡，細胞相對比較大，且相對于外表皮顏色很淺，所以可以用相應的染色劑來染色，較容易觀察到細胞的各種結構，也可以得到明顯的誘導效果，因此本實驗選用洋蔥鱗莖內表皮細胞作為實驗材料．

細胞凋亡是一種生理性死亡行為，等同于細胞程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表達以及調控等．近年來，國內外學者不僅對細胞凋亡在生物體生長發(fā)育中的作用及體外誘導劑和逆境對細胞凋亡的影響進行了大量的研究[1-8]，而且對凋亡的分子機制及信號轉導也進行了深入地探討[9-13]．

植物的某些特定細胞除了能夠在正常生長發(fā)育的特定時期發(fā)生細胞凋亡外，理化及一些生物因子等逆境脅迫也可誘導植物細胞發(fā)生類似細胞凋亡的典型形態(tài)和生化特征[14-21]．逆境脅迫誘導的植物細胞凋亡在植物界相當普遍，其中金屬離子是主要的影響因素之一．當鎂、鋅、銅、錳、鈉、鐵、鈣等金屬離子的量比較少時，對植物的正常生長發(fā)育反而有利；當這些離子的含量比較多時，就會抑制植物的生長發(fā)育，植物體細胞也會受到損傷[6,22-27]．目前有關鈣離子對洋蔥內表皮細胞凋亡的影響研究未見報道，本實驗設置了鈣離子不同處理濃度與處理時間，通過觀察在不同處理濃度與處理時間組合作用下洋蔥鱗莖內表皮細胞凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)、統(tǒng)計細胞凋亡率、測定丙二醛含量，探索鈣離子對細胞凋亡的誘導作用，為探索植物細胞的凋亡機制提供參考．

1材料與方法

1.1實驗材料

隔年洋蔥，由周口師范學院生命科學與農學學院提供．

1.2試劑

PBS緩沖液、CaCl2溶液、改良苯酚品紅染液、10%的三氯乙酸、0.6%的硫代巴比妥酸等．

1.3實驗方法

1.3.1洋蔥的復蘇培養(yǎng)

取隔年洋蔥，首先將其鱗莖外部幾層干枯的表皮剝除，剪掉干枯的老根(勿傷根芽)，充分洗凈后置于盛有清水的燒杯中，使根部與水接觸，于25 ℃條件下培養(yǎng)，每天換水，并每天觀察洋蔥的發(fā)根情況，當露出幼嫩的白根時，表明洋蔥已經復蘇．

1.3.2PBS緩沖液的配制

PBS緩沖液的配制：稱取一定量的磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀，放入燒杯中，加適量蒸餾水，并用玻璃棒充分攪拌使其完全溶解，然后加入1 mol/L的氫氧化鈉，調pH值至7.4，最后定容至1 000 mL，配制出0.2 mol/L的PBS緩沖液，保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.3不同濃度Ca2+溶液的配制

分別稱取一定量的氯化鈣，放入4個燒杯中，分別往燒杯中加入備用的PBS緩沖液適量，并用玻璃棒充分攪拌使其完全溶解，最后定容至1 000 mL，配制成0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L的CaCl2溶液．

1.3.4改良苯酚品紅染液的制備

參照盧龍斗[28]等方法制備改良苯酚品紅染液．

1.3.510%三氯乙酸的配制

稱取10 g三氯乙酸放入燒杯中，加蒸餾水溶解，最后定容至100 mL，配制出10%的三氯乙酸，保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.60.6%硫代巴比妥酸的配制

稱取0.6 g硫代巴比妥酸放入燒杯中，先加少量的1 mol/L的氫氧化鈉溶解，再用10%的三氯乙酸定容至100 mL，配制出0.6%的硫代巴比妥酸，保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.7實驗處理設置及細胞凋亡的形態(tài)觀察

取經過復蘇培養(yǎng)的洋蔥，切取0.5 cm2的內表皮若干．分別用0.2，0.4，0.6，0.8 mol/L的Ca2+(CaCl2)處理內表皮1 h和8 h后，取出放于標記好的燒杯中，再經改良苯酚品紅染色后，壓片觀察．以0 mol/L Ca2+處理為正對照，取正對照中一部分內表皮放入燒杯內，加水煮沸10 min，使細胞呈壞死態(tài)為負對照，各處理均設置3個重復．光學顯微鏡下比較凋亡細胞與正常細胞(正對照)、壞死細胞(負對照)在形態(tài)學上的異同，對細胞形態(tài)特征拍照，并計算細胞凋亡率．細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/視野中觀察的細胞總數×100．

1.3.8丙二醛(MDA)含量的測定

參照劉萍[29]等的方法并稍作改進，測定細胞中丙二醛(MDA)含量，測定時設置3個重復，最終含量用平均值表示．具體測定方法如下：

分別稱取實驗各處理組洋蔥鱗莖內表皮0.15 g，加2 mL 10%的三氯乙酸以及少量石英砂于研缽中充分研磨，研磨至勻漿，再用8 mL 10%的三氯乙酸進一步研磨后，定容至10 mL，勻漿以4 000 r/min離心10 min，其上清液即為MDA提取液．

取2 mL MDA提取液(正對照加2 mL PBS緩沖液)，向每個試管提取液中各加入2 mL 0.6%的硫代巴比妥酸溶液，充分搖勻．置沸水浴中煮沸15 min，立即放入冷水中冷卻．4 000 r/min離心10 min，取上清液，用分光光度計測其450，532，600 nm處的OD值．

MDA(μmol/gFW)=[6.45×(D532-D600)-0.56×D450]×VT/(V1×W)

1.3.9實驗數據分析

采用Excel 2007作圖，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析數據，多重比較采用Duncan法．

2結果與分析

2.1對照組細胞形態(tài)結構觀察

圖1　對照組細胞形態(tài)結構圖(10×10)

對照組細胞形態(tài)結構見圖1．圖1顯示，正對照組細胞即正常細胞之間的界限分明，細胞輪廓清晰，細胞質透明，細胞膜完整無損，背景干凈，細胞核呈球形．負對照組細胞即壞死之間的界限及細胞輪廓消失，細胞膜、細胞壁完全裂解，部分細胞核也發(fā)生裂解并且其形狀和位置均發(fā)生一定變化，細胞內出現(xiàn)塊狀物質，背景不干凈，細胞不能保持結構的完整．

2.2不同濃度Ca2+處理1 h后細胞凋亡觀察

a.0.2 mol/L CaCl2處理1 h ; b.0.4 mol/L CaCl2處理1 h;

c.0.6 mol/L CaCl2處理1 h; d.0.8 mol/L CaCl2處理1 h

圖2不同濃度Ca2+處理1 h后的細胞形態(tài)結構圖(16×10)

不同濃度Ca2+處理1 h后，細胞凋亡觀察結果見圖2．圖2顯示，不同濃度Ca2+處理1 h后，細胞在形態(tài)上的表現(xiàn)主要為：細胞背景不干凈，細胞內出現(xiàn)碎末狀或塊狀物質，細胞發(fā)生質壁分離但程度不高，細胞的染色質有一定程度的邊緣化，部分細胞質發(fā)生濃縮，細胞核不完整，并且出現(xiàn)空泡，部分細胞核緊貼細胞膜分布，形狀呈不規(guī)則長條形．

2.3不同濃度Ca2+處理8 h后細胞凋亡觀察

e.0.2 mol/L CaCl2處理8 h ; f.0.4 mol/L CaCl2處理8 h;

g.0.6 mol/L CaCl2處理8 h; h.0.8 mol/L CaCl2處理8 h

圖3 不同濃度Ca2+處理8 h后的細胞形態(tài)結構圖(16×10)

不同濃度Ca2+處理8 h后，細胞凋亡觀察結果見圖3．由圖3可知，不同濃度Ca2+處理8 h后，細胞形態(tài)特征發(fā)生了更明顯的變化．主要表現(xiàn)為：細胞背景極不干凈，細胞內不均勻的塊狀物很明顯，細胞質壁嚴重分離，部分細胞的細胞膜已經破裂，染色質有較大量的濃縮，較多細胞核邊緣界限模糊，不完整，泡狀結構也更明顯．

2.4不同濃度Ca2+處理下洋蔥內表皮細胞凋亡率統(tǒng)計分析

不同濃度的Ca2+處理1 h和8 h后，細胞凋亡率統(tǒng)計分析結果見圖4．圖4顯示，隨著Ca2+處理濃度的增加及處理時間的延長，細胞凋亡率均呈上升趨勢，即Ca2+處理濃度和處理時間與細胞凋亡率均成正比．圖4還顯示，各處理間差異達到顯著水平．這說明細胞凋亡率受Ca2+處理濃度和處理時間的雙重影響，Ca2+處理時間對細胞凋亡率的影響更明顯．

2.5不同濃度Ca2+處理下洋蔥內表皮細胞中丙二醛(MDA)含量統(tǒng)計分析

不同濃度的Ca2+處理1 h和8 h后，洋蔥鱗莖內表皮細胞中MDA含量及統(tǒng)計分析結果見圖5．圖5顯示，Ca2+處理組丙二醛含量隨著Ca2+處理時間的延長及Ca2+處理濃度的增加呈現(xiàn)升高趨勢，正對照組細胞中MDA含量均低于Ca2+處理組，并且Ca2+處理組與正對照組之間MDA含量差異達到顯著水平．Ca2+處理1 h時，MDA含量在各Ca2+處理濃度間差異不顯著，Ca2+處理8 h時，高Ca2+處理濃度(0.8 mol/L)與低Ca2+處理濃度(0.2，0.4，0.6 mol/L)之間MDA含量差異顯著，低Ca2+處理濃度(0.2，0.4，0.6 mol/L)之間MDA含量差異不顯著．各種Ca2+處理濃度下，處理時間長(8 h)短(1 h)顯著影響洋蔥鱗莖內表皮細胞中MDA含量．綜上所述，Ca2+處理濃度與處理時間均對洋蔥鱗莖內表皮細胞中MDA含量產生影響，但Ca2+處理時間的影響程度更高．

圖上不同小寫字母表示差異達

A1:正對照; A2:0.2 mol/L Ca2+處理1 h; A3:0.4 mol/L Ca2+處理1 h; A4:0.6 mol/L Ca2+處理1 h; A5:0.8 mol/L Ca2+處理1 h; A6:0.2 mol/L Ca2+處理8 h; A7:0.4 mol/L Ca2+處理8 h; A8:0.6 mol/L Ca2+處理8 h; A9:0.8 mol/L Ca2+處理8 h.

圖5丙二醛含量統(tǒng)計分析結果

3討論

本實驗結果表明：正對照組細胞形態(tài)正常，輪廓清晰，結構完整；負對照組細胞輪廓消失，不能保持細胞的完整形態(tài)；Ca2+處理組細胞出現(xiàn)不同程度的質壁分離，細胞輪廓發(fā)生不同程度的變化，細胞核、細胞質、細胞膜等細胞結構也發(fā)生不同程度的變化，但還能維持細胞的完整，細胞形狀變?。S著Ca2+處理濃度的增加和處理時間的延長，細胞凋亡率和內表皮細胞中丙二醛含量均上升．

在動植物細胞凋亡研究中，關鍵就是實驗材料的選擇，線蟲是動物細胞凋亡研究中比較合適的材料，而植物細胞凋亡研究中還未找到合適的實驗材料．本研究選擇隔年洋蔥作為實驗材料，在Ca2+作用1 h后就可以觀察到細胞凋亡在形態(tài)上發(fā)生的變化，細胞凋亡率及細胞內丙二醛含量變化也比較明顯，而且洋蔥還具備廉價、培養(yǎng)方便等優(yōu)點，因此選擇洋蔥作為植物細胞凋亡研究材料是可行的．

Ca2+之所以可以誘導細胞凋亡，可能因為Ca2+能刺激線粒體外膜上的受體，使線粒體膜通透性增高，這可以導致凋亡誘導因子及細胞色素C等促凋亡物質的釋放，結果出現(xiàn)細胞凋亡[30]．動物細胞中很容易觀察到凋亡小體，而植物細胞中很難觀察到.因為動植物細胞具有明顯的區(qū)別，即植物細胞具有細胞壁、液泡和葉綠體而動物細胞缺少這些結構，這些特有的結構可以在細胞凋亡中起到關鍵的作用[31]．本實驗結果顯示，洋蔥內表皮細胞凋亡中并未觀察到凋亡小體，這與羅琦[6]等及潘建偉[27]等研究結果相似．

在有體外誘導劑的情況下，用普通光學顯微鏡可以看到凋亡的細胞在早期形態(tài)和結構上發(fā)生了一定的變化，比如：細胞核染色比較深，出現(xiàn)固縮，有時候還會出現(xiàn)裂解，細胞形狀變小等．當誘導劑濃度增加或者誘導時間延長時，凋亡細胞在后期會發(fā)生繼發(fā)性壞死現(xiàn)象，壞死細胞會發(fā)生細胞膜破裂、細胞內的物質外泄、細胞崩解等現(xiàn)象．因此在進行細胞凋亡現(xiàn)象觀察時，為了獲得更好的實驗效果，必須掌握好觀察時間．本實驗中，Ca2+作用8 h時，細胞凋亡現(xiàn)象更明顯，細胞凋亡率也較高．

本實驗通過光學顯微鏡觀察到的凋亡細胞比較客觀，而且實用又簡便．這種方法也常用于外源藥物誘導腫瘤細胞凋亡實驗中或者用于腫瘤組織切片中對凋亡細胞進行計數．存在的主要缺點是凋亡細胞在早期其形態(tài)學變化還不太明顯，從而造成計數誤差．

本實驗僅對Ca2+處理下洋蔥內表皮細胞形態(tài)特征、細胞凋亡率及細胞中生理指標變化進行了分析，至于洋蔥內表皮細胞發(fā)生凋亡時，有哪些因子作用，這些因子又作用到細胞的什么部位，有哪些信號分子參加并調節(jié)，信號分子的作用機制等還有待進一步研究．

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Study on apoptosis of onion induced by calcium ion

ZHAO Jinhui, HE Le, ZHANG Fan, GUO Ning, HU Lizong, WANG Junsheng

(College of Life Science and Agronomy, Zhoukou Normal University, Zhoukou 466001, China)

Abstract:Utilizing onion bulb as experimental material to study the effect of different concentration of calcium ion under different processing time on apoptosis in intraepidermal cells of onion bulb. The results indicated that apoptosis generated in intraepidermal cells of onion bulb only after one hour by different concentration of calcium ion, with increased concentration and prolonged processing time of calcium ion, apoptosis phenomenon was more obvious, apoptosis rate and MDA content all went up. The above showed that under a certain concentration and processing time of calcium ion, cellular morphology and cell apoptosis rate and MDA content in intraepidermal cells of onion bulb all suffered varying degrees of effect.

Key words:calcium ion；intraepidermal cells of onion bulb；apoptosis rate；MDA content

收稿日期：2015-12-20;修回日期：2016-01-06

基金項目：國家自然科學基金項目(No.41271280)

作者簡介：趙錦慧(1979- )，女，河南周口人，碩士，講師，主要從事動植物細胞遺傳分析及植物逆境生理研究工作．

中圖分類號：Q942

文獻標志碼：A

文章編號：1671-9476(2016)02-0116-05

DOI：10.13450/j.cnki.jzknu.2016.02.029