劉　瑋　張韶英　徐慧敏　管斯斯

(武漢市中心醫(yī)院老年科，湖北　武漢　430014)

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Klotho基因G-395A多態(tài)性與華中地區(qū)老年漢族人群頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度的相關(guān)性

劉瑋張韶英徐慧敏管斯斯

(武漢市中心醫(yī)院老年科，湖北武漢430014)

〔摘要〕目的探討Klotho基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與華中地區(qū)老年(年齡≥60歲)漢族人群頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)的相關(guān)性。方法隨機(jī)選取278例華中地區(qū)老年漢族患者，根據(jù)IMT分為IMT增厚組(IMT≥1 mm，132例)和對(duì)照組(IMT<1 mm，146例)，分別檢測(cè)各組血壓、血糖、血脂等生化指標(biāo)，并用TaqMan基因探針?lè)z測(cè)各組Klotho基因G-395A位點(diǎn)的基因型。結(jié)果與對(duì)照組相比，IMT增厚組GG基因型和G等位基因頻率明顯增高，AA基因型和A等位基因頻率明顯降低，AG基因型無(wú)明顯差異。經(jīng)多元Logistic回歸分析后，G等位基因頻率與IMT增厚存在相關(guān)性，為IMT增厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。結(jié)論Klotho基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與華中地區(qū)老年漢族人群頸動(dòng)脈IMT具有相關(guān)性，G-395A多態(tài)性有可能作為頸動(dòng)脈IMT增厚的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。

〔關(guān)鍵詞〕Klotho基因；單核苷酸多態(tài)性；頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度；動(dòng)脈粥樣硬化

Klotho基因是Kuro-o等〔1〕于1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因。Klotho基因被敲除的小鼠可出現(xiàn)類似人類衰老的各種表型，如壽命縮短、不育癥、動(dòng)脈硬化、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松、肺氣腫等〔2〕。目前的研究表明，Klotho基因與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。Klotho基因缺陷的小鼠在出生4 w后即可出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，并隨著增齡而加重，表現(xiàn)為主動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化、肌性動(dòng)脈中層鈣化、內(nèi)膜增厚，這些變化與人類動(dòng)脈粥樣硬化非常相似〔1〕。把外源性正常Klotho cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)給Klotho基因缺陷的小鼠后，其動(dòng)脈粥樣硬化程度可得到顯著改善〔2〕。頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)增厚是動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程中的早期標(biāo)志，是反映大動(dòng)脈粥樣硬化的早期的、無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)〔3，4〕。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)Klotho基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈IMT增厚相關(guān)性的研究極少。本研究擬通過(guò)對(duì)Klotho基因G-395A多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，探討Klotho基因的G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與老年人群頸動(dòng)脈IMT增厚的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象樣本來(lái)自2012年3～11月武漢市中心醫(yī)院老年科，隨機(jī)選取年齡≥60歲的老年住院病人278例，男136例，女142例，年齡60～97歲。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥60歲，無(wú)親屬相關(guān)關(guān)系的、愿意接受項(xiàng)目研究者即可。所有參加研究對(duì)象均告知并簽署知情同意書。記錄入選病例的年齡，吸煙史，測(cè)量身高、體重、計(jì)算體重指數(shù)(BMI)，測(cè)量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，清晨空腹采血化驗(yàn)血糖、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2頸動(dòng)脈超聲檢查患者取臥位，頸部側(cè)伸45°，測(cè)定頸動(dòng)脈IMT(以頸動(dòng)脈球形膨脹近端1 cm范圍內(nèi)作為頸總動(dòng)脈測(cè)量區(qū)域，以頸總動(dòng)脈后壁作為測(cè)量部位)，測(cè)定最厚處及距此遠(yuǎn)心1 cm 和近心1 cm 點(diǎn)，左右兩側(cè)共6點(diǎn)的平均值作為結(jié)果。按照頸動(dòng)脈IMT進(jìn)行分組。IMT<1.0 mm 者入對(duì)照組(146例)；IMT≥1.0 mm者入IMT 增厚組(132例，包括發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈斑塊者89例)。其中每組又根據(jù)年齡分為老年組(年齡<80歲)和高齡組(年齡≥80歲)兩個(gè)亞組。

1.3方法

1.3.1DNA提取留取全部對(duì)象早晨空腹全血標(biāo)本，抽取肘正中靜脈血5 ml，EDTA抗凝，用中國(guó)大連寶生物工程技術(shù)有限公司(TaKaRa)DNA抽提試劑盒提取DNA。

1.3.2Klotho基因G-395A SNP 檢測(cè)通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心的GenBank獲取基因序列及其相應(yīng)位點(diǎn)的SNP 信息。其中G-395A對(duì)應(yīng)的SNP為rs1207568。由美國(guó)ABI公司合成TaqMan 引物和探針，用2×TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI，貨號(hào)：4351379，批號(hào)：P130715-008E09)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，熒光定量PCR儀(ABI Stepone plus型)上進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物：5′-TAGGGCCCGGCAGGAT-3＇；下游引物：5′-CCTGGAGCGGCTTCGTC-3＇。探針1：(VIC)-AGTCGGGAAAAGT-(MGB)；探針2：(FAM)-CAAGTCGGGGAAAG-(MGB) 。反應(yīng)體系為：采用20 μl 反應(yīng)體系，其中2×TaqMan Master Mix 10 μl，40×引物和TaqMan探針混合物0.5 μl，模板 DNA 2.0 μl，ddH2O 7.5 μl。PCR 反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，隨即進(jìn)入PCR 循環(huán)，95℃變性15 s，60℃退火和延伸各1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)，研究對(duì)象基因型與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用多元Logistic回歸分析基因型與IMT增厚的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1IMT增厚組與對(duì)照組臨床資料分析兩研究組年齡、DBP、TC、TG、BMI無(wú)顯著差異(P>0.05)；IMT增厚組血糖、SBP、LDL-C水平、男性及吸煙比例明顯高于對(duì)照組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)(表1)。

表1　兩組臨床資料比較±s)

2.2Klotho G-395A SNP分析Klotho基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。與對(duì)照組相比，IMT增厚組GG基因型及G等位基因頻率均明顯升高(P<0.05)，IMT增厚組AA基因型及A等位基因頻率均明顯降低(P<0.05)，兩組AG基因型頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表2)。亞組分析，與對(duì)照組相比，老年組以及高齡組患者的AA基因型及A等位基因頻率均明顯降低(P<0.05)，G等位基因頻率明顯增加(P<0.05)，AG基因型頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高齡組較對(duì)照組GG基因型明顯增加(P<0.05)，而老年組與對(duì)照組的GG基因型無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

2.3Klotho基因G-395A位點(diǎn)G等位基因頻率與老年患者IMT增厚的關(guān)系在調(diào)整年齡、性別、吸煙、血壓、血脂和血糖等因素并經(jīng)多元Logistic回歸分析后，G等位基因頻率與IMT增厚存在相關(guān)性，G等位基因?yàn)镮MT增厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而A等位基因頻率與IMT增厚存在負(fù)相關(guān)性，A等位基因?qū)︻i動(dòng)脈IMT增厚具有保護(hù)作用(表4)。

表2　Klotho基因 G-395A 多態(tài)性分布〔n(%)〕

表3　不同年齡亞組Klotho基因G-395A多態(tài)性分布〔n(%)〕

表4　多元Logistic回歸分析

3討論

研究表明人類Klotho基因多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病相關(guān)，如Kl-VS等位基因、G-395A多態(tài)性、C-1818T多態(tài)性等〔5～8〕。新近研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因啟動(dòng)區(qū)G-395A位點(diǎn)基因突變有可能就是該基因表達(dá)的一種潛在的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)〔9〕。國(guó)外學(xué)者Imamura等〔10〕研究日本人群Klotho基因G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶者其冠心病患病率較高。而同期Rhee等〔6〕在研究韓國(guó)60歲以上人群時(shí)，發(fā)現(xiàn)A等位基因?qū)谛牟【哂斜Ｗo(hù)作用。在國(guó)內(nèi)研究中，王虎林等〔11〕研究報(bào)道了在重慶地區(qū)的漢族人群中，Klotho基因G-395A位點(diǎn)A等位基因攜帶頻率與動(dòng)脈硬化呈負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明Klotho基因啟動(dòng)區(qū)G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的關(guān)系可能存在著地域和年齡效應(yīng)。

血管壁IMT增厚是動(dòng)脈粥樣硬化的早期征象，頸動(dòng)脈和近心段的冠狀動(dòng)脈由于所處的解剖部位比較特殊，血流的剪切力比較小，易于形成易損斑塊，造成動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，管腔狹窄。頸動(dòng)脈由于其位置表淺，用超聲檢測(cè)IMT的厚度可作為反映全身動(dòng)脈硬化的一個(gè)窗口。IMT與動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素?cái)?shù)量間存在相關(guān)性，IMT的進(jìn)展程度與速度更能反映或預(yù)測(cè)冠心病〔12，13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明了G-395A位點(diǎn)多態(tài)性與頸動(dòng)脈IMT增厚的關(guān)系可能存在著年齡效應(yīng)，G等位基因頻率與頸動(dòng)脈IMT增厚存在相關(guān)性，為IMT增厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，而A等位基因?qū)︻i動(dòng)脈IMT增厚具有保護(hù)作用。這與Rhee等〔6〕和王虎林等〔11〕的研究結(jié)果相符。目前對(duì)Klotho基因G-395A位點(diǎn)與冠心病的相關(guān)性研究有不同的研究結(jié)果。分析其原因首先可能與被研究人群的年齡、地區(qū)和種族差異以及冠心病的類型不同有關(guān)。其次，可能與樣本量與其他基因的交互作用有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示Klotho基因啟動(dòng)子G-395A位點(diǎn)可能是中國(guó)華中地區(qū)漢族人群IMT增厚的易感性位點(diǎn)和預(yù)測(cè)指標(biāo)。

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〔2014-12-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：武漢市科技局資助課題(No.201260523187-4)；武漢市衛(wèi)生局資助課題(No.YB14B05)；院內(nèi)基金(No.YB14B05)

通訊作者：張韶英(1963-)，女，學(xué)士，主任醫(yī)師，主要從事衰老及動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究。

〔中圖分類號(hào)〕R543.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2132-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.037

第一作者：劉瑋(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事衰老及動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究。