王榮勤　曾憲強(qiáng)　馬彥高

(南陽市中心醫(yī)院介入科，河南　南陽　473009)

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降鈣素基因相關(guān)肽對頸動脈球囊介入損傷后大鼠新生內(nèi)膜形成的影響

王榮勤曾憲強(qiáng)馬彥高

(南陽市中心醫(yī)院介入科，河南南陽473009)

〔摘要〕目的探討降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對頸動脈球囊介入損傷后大鼠新生內(nèi)膜形成的影響。方法采用雄性SD大鼠建立頸總動脈球囊損傷模型，將60只模型大鼠隨機(jī)分為對照組，低劑量CGRP(CGRP-L)組和高劑量CGRP(CGRP-H)組。CGRP-L組和CGRP-H組于球囊損傷后每天腹腔注射50、100 μg/kg CGRP，而對照組于球囊損傷后每天腹腔注射等體積生理鹽水。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)動員情況，酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血中促血管修復(fù)因子〔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1和堿性成纖維因子(bFGF〕及血清內(nèi)皮素(ET)-1水平，分光光度法檢測血清一氧化氮(NO)水平，HE染色觀察頸動脈在球囊損傷后的形態(tài)學(xué)變化及內(nèi)膜增生情況。 結(jié)果CGRP-L組和CGRP-H組外周血中 CD34 和 VEGF受體共同標(biāo)記的 EPC動員比例分別為(15.26±2.70)%和(23.55±3.92)%，均高于對照組的(7.12±1.14)%(P<0.05)；與對照組相比，CGRP-L處理后的VEGF、SDF-1、bFGF、EGF及NO水平均升高，ET-1水平降低，且內(nèi)膜面積、中膜面積及兩者比值均降低(P<0.05)；CGRP-H組的以上指標(biāo)均優(yōu)于CGRP-L組(P<0.05)。結(jié)論CGRP可抑制頸動脈球囊介入損傷后大鼠新生內(nèi)膜形成，可通過促進(jìn)EPC動員及升高外周血促血管修復(fù)因子輔助內(nèi)皮損傷修復(fù)。

〔關(guān)鍵詞〕降鈣素基因相關(guān)肽；頸動脈；球囊介入損傷；新生內(nèi)膜形成

目前，經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)等介入手段已普遍用于嚴(yán)重心血管疾病的治療，但其引起的血管內(nèi)皮損傷已成為介入治療后再狹窄的主要原因，嚴(yán)重影響了遠(yuǎn)期預(yù)后〔1，2〕。改善介入后局部動脈內(nèi)皮功能障礙是心血管疾病介入治療領(lǐng)域的難題。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)血管擴(kuò)張肽〔3，4〕，具有多種生理活性，如神經(jīng)保護(hù)和改善腦部血流〔5〕。近期研究發(fā)現(xiàn)其具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用，如歐奇林等〔6〕發(fā)現(xiàn)CGRP對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。本研究擬在經(jīng)典頸總動脈球囊損傷模型上驗證CGRP的保護(hù)效果。

1材料與方法

1.1主要試劑CGRP購自美國Sigma公司；APC標(biāo)記的CD34單克隆流式抗體、PE標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-2單克隆流式抗體，購自美國B&D公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，北京(中西泰安)技術(shù)服務(wù)有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，堿性成纖維因子(bFGF)和內(nèi)皮素(ET)-1的ELISA檢測試劑盒購自碧云天生物科技公司，一氧化氮(NO)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2動物與分組選取雄性SD大鼠60只(體重320～350 g)用于頸總動脈球囊損傷模型的建立，根據(jù)實(shí)驗設(shè)計分為對照組，低劑量CGRP(CGRP-L)組和高劑量CGRP(CGRP-H)組，每組20只。CGRP-L組和CGRP-H組于球囊損傷后每天腹腔注射50、100 μg/kg CGRP，而對照組于球囊損傷后每天腹腔注射等體積生理鹽水。本實(shí)驗所用大鼠均購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司，均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境〔濕度60%～70%、室溫(21±1)℃及12 h/12 h明暗周期〕，可自由獲取飲水、飲食。

1.3頸總動脈球囊損傷模型的建立〔7〕水合氯醛麻醉后行頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，采用1號線結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端(采用動脈夾夾閉其余兩條動脈)，于結(jié)扎線下剪開一小口，采用導(dǎo)絲將球囊經(jīng)頸外動脈切口送入頸總動脈，以3 atm 壓力擴(kuò)張球囊，取下頸總動脈夾，順勢將球囊送至距頸內(nèi)外動脈分叉處近心端約2 cm處，并來回抽拉3次。將球囊退出后將頸外動脈結(jié)扎，恢復(fù)頸內(nèi)動脈血流后，進(jìn)行常規(guī)縫合及青霉素處理。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)動員情況每組于治療14 d后各取6只大鼠，戊巴比妥溶液麻醉后，心臟取血5 ml，經(jīng)D-Hank平衡液、Percol分離液處理后離心30 min，采用D-Hank平衡液洗滌中間細(xì)胞層，重懸細(xì)胞后加入APC-CD34 和PE-VEGFR-2 流 式 抗 體 各 5 μl，30 min 后上機(jī)檢測APC-CD34和PE-VEGFR-2雙陽性細(xì)胞比例。

1.5外周血促血管修復(fù)因子檢測每組于治療14 d后各取6只大鼠，戊巴比妥溶液麻醉后，心臟取血5 ml，室溫靜置 30 min 后(不加抗凝劑)，離心20 min后取血清，采用ELISA試劑盒檢測VEGF、EGF、SDF-1及bFGF水平，操作過程嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

1.6血清血管活性物質(zhì)檢測每組于治療3、7、14 d各取3只大鼠，采用1.5中的方法制備血清，采用ELISA試劑盒檢測ET-1水平，分光光度法檢測NO水平。

1.7頸總動脈標(biāo)本采集每組于治療14 d后各取6只大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉后取出左頸總動脈1～2 cm，采用4%多聚甲醛溶液固定及石蠟包埋后均勻切片，經(jīng)HE染色后觀察頸動脈在球囊損傷后的形態(tài)學(xué)變化及內(nèi)膜增生情況，最終結(jié)果表示為內(nèi)膜與中膜面積比值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果

2.1CGRP處理對EPC動員的影響CGRP-L組和CGRP-H組外周血中 CD34 和 VEGFR 共同標(biāo)記的 EPC動員比例分別為(15.26±2.70)%和(23.55±3.92)%，均高于對照組的(7.12±1.14)%(P<0.05)；CGRP-H組的外周血中EPC動員比例高于CGRP-L組。

2.2CGRP處理對大鼠頸動脈新生內(nèi)膜的影響與對照組相比，CGRP-L組和CGRP-H組的內(nèi)膜面積及中膜面積均降低，且內(nèi)膜與中膜面積的比值亦降低(P<0.05)；CGRP-H組的以上指

標(biāo)均優(yōu)于CGRP-L組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1　各組大鼠頸動脈新生內(nèi)膜和中膜面積及

與對照組比較：1)P<0.05；與CGRP-L組比較：2)P<0.05；下表同

圖1　各組大鼠頸動脈內(nèi)膜新生情況(HE，×100)

2.3CGRP處理對大鼠血清血管活性物質(zhì)的影響與對照組相比，CGRP-L組和CGRP-H組損傷3、7、11 d后血清ET-1水平降低，而NO水平升高(P<0.05)；CGRP-H組的血清ET-1和NO水平均優(yōu)于CGRP-L組(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠血清血管活性物質(zhì)的水平分析±s,n=3)

2.4CGRP處理對外周血促血管修復(fù)因子的影響與對照組相比，CGRP-L組和CGRP-H組外周血的VEGF、SDF-1、bFGF及EGF水平均升高(P<0.05)；CGRP-H組的以上指標(biāo)均高于CGRP-L組(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠外周血促血管修復(fù)因子的水平

3討論

血管內(nèi)皮損傷是血管疾病介入治療后再狹窄的主要病理原因之一〔8〕。CGRP作為人體內(nèi)含量最豐富的神經(jīng)肽，廣泛參與了心血管系統(tǒng)生理和病理的調(diào)節(jié)，如CGRP可促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的合成〔9〕，同時促進(jìn)人表皮靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移〔10〕。研究已證實(shí)EPC是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可在機(jī)體發(fā)生血管損傷時，直接從骨髓動員至外周血來參與血管內(nèi)皮修復(fù)，而將CGRP轉(zhuǎn)染EPC后可抑制血管內(nèi)皮增殖〔11〕，以上結(jié)果表明CGRP對血管內(nèi)皮損傷修復(fù)有積極作用。

本研究表明CGRP可增強(qiáng)EPC動員，機(jī)體外周血中EPC含量上升時可發(fā)揮對損傷血管的修復(fù)作用，推測主要與促進(jìn)損傷部位內(nèi)皮細(xì)胞分化及抑制內(nèi)膜增生有關(guān)〔12〕。外周血中的促血管修復(fù)因子在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，可通過誘導(dǎo)血管新生及EPC動員參與血管修復(fù)〔13，14〕。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CGRP處理后4種因子的水平均升高，且高濃度CGRP處理后的升高程度高于低濃度，進(jìn)一步表明CGRP對血管內(nèi)皮損傷修復(fù)有較好的促進(jìn)效果。

血管活性物質(zhì)直接參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，如血管損傷后會導(dǎo)致ET-1水平直接升高，因此ET-1水平可反映血管損傷程度〔15〕；而NO直接參與了血管的舒張，降低了血流速度，兩者的平衡對于維持血管正常功能至關(guān)重要〔15，16〕。本研究結(jié)果提示CGRP亦可通過維持ET-1、NO水平平衡來發(fā)揮促血管內(nèi)皮損傷修復(fù)作用。

為直觀評價CGRP對血管損傷修復(fù)的效果，本研究采用HE染色從形態(tài)學(xué)上觀察頸動脈損傷大鼠血管新生內(nèi)膜增生情況，結(jié)果表明CGRP可抑制血管內(nèi)膜新生，有利于保持血管通暢，減少血管再狹窄的發(fā)生。

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〔2015-09-13修回〕

(編輯徐杰)

第一作者：王榮勤(1970-)，女，主管護(hù)師，主要從事介入護(hù)理研究。

〔中圖分類號〕R54

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2082-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.015