楊　瓊　戴桃李　陳　粲　潘　婭

(貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州　貴陽(yáng)　550025)

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穴位埋線聯(lián)合鹽酸甲氯芬酯對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)幾種重要蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

楊瓊戴桃李1陳粲2潘婭2

(貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

〔摘要〕目的探討穴位埋線與鹽酸甲氯芬酯聯(lián)合治療血管性癡呆(VD)大鼠的神經(jīng)生化機(jī)制。方法改良四血管阻斷法建立VD大鼠模型；造模后分3個(gè)治療組，分別為鹽酸甲氯芬酯治療組、“腎俞” 、“足三里”穴位埋線治療組(埋線組)及鹽酸甲氯芬酯聯(lián)合穴位埋線組(聯(lián)合組)；免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)并比較各組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)三種重要蛋白質(zhì)的表達(dá)情況：膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)。結(jié)果經(jīng)聯(lián)合治療后，大鼠海馬CA1區(qū)ChAT、BDNF免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，各項(xiàng)指標(biāo)與單獨(dú)治療組相比，差異明顯(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論鹽酸甲氯芬酯聯(lián)合穴位埋線治療法，對(duì)VD大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元具有良好的保護(hù)作用，這可能與其上調(diào)海馬BDNF及下調(diào)Caspase-3密切相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕鹽酸甲氯芬酯；穴位埋線；血管性癡呆；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶

目前血管性癡呆(VD)尚無(wú)特效治療方法。鹽酸甲氯芬酯是中樞興奮藥，臨床上主要用于腦外傷昏迷、腦卒中、小兒遺尿、精神錯(cuò)亂等的治療，這與其具有抗缺血、缺氧等作用有關(guān)〔1〕。中醫(yī)療法具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)毒副作用、標(biāo)本兼治的優(yōu)勢(shì)〔2〕。本研究采用鹽酸甲氯芬酯聯(lián)合“腎俞”、“足三里”穴位埋線方法進(jìn)行治療，并檢測(cè)VD大鼠腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)——海馬處膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)三種重要蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，探討鹽酸甲氯芬酯聯(lián)合“腎俞”、“足三里”穴位埋線聯(lián)合應(yīng)用對(duì)VD模型大鼠的影響及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑5～6月齡健康雄性SD大鼠75只，體重280～300 g，清潔級(jí)，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。鹽酸甲氯芬酯膠囊(廣東先強(qiáng)藥業(yè)有限公司)。ChAT 試劑盒、BDNF試劑盒、Caspase-3試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備大鼠隨機(jī)平均分五組：假手術(shù)組、模型組、鹽酸甲氯芬酯治療組(甲氯芬酯組)、“腎俞”、“足三里”穴位埋線治療組(埋線組)、鹽酸甲氯芬酯及穴位埋線聯(lián)合治療組(聯(lián)合組)。采用改良Pulsinelli四血管阻斷 (4-VO) 法建立VD大鼠模型：模型組和治療組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉后，行背側(cè)頸正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔，用電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞；再將大鼠行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用；24 h后用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，5 min×3次，每次間隔1 h。假手術(shù)組處理步驟同上，但不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉。模型制作成功檢驗(yàn)：大鼠在4條血管阻斷后，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。不符合標(biāo)準(zhǔn)者剔除。

1.2.2治療方法甲氯芬酯組和聯(lián)合組用鹽酸甲氯芬酯(100 mg·kg-1·d-1)溶于2 ml水中灌胃；假手術(shù)組、模型組和埋線組給予相同體積的蒸餾水灌胃。同時(shí)埋線組和聯(lián)合組按照?qǐng)D譜定位〔3〕，在雙側(cè)“腎俞”穴、“足三里”穴常規(guī)消毒后，用8號(hào)注射針頭埋入0.5 cm長(zhǎng)的(4～0)醫(yī)用羊腸線。整個(gè)治療連續(xù)4 w。未滿4 w中途死亡者被剔除。

1.2.3免疫組化染色麻醉大鼠，自左心室插管灌注生理鹽水和10%中性甲醛以固定鼠腦，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋處理后，行鼠腦海馬冠狀位切片，片厚4～5 μm。每只大鼠每個(gè)指標(biāo)切5張片。免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)海馬CA1區(qū)ChAT、BDNF、Caspase-3的表達(dá)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每張切片取5個(gè)視野，每個(gè)視野采集一幅圖像，計(jì)數(shù)ChAT、 BDNF、Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為最后結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及S-N-K檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1海馬CA1區(qū)ChAT的表達(dá)ChAT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞在鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)有棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)有大量ChAT陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞分布，且胞質(zhì)內(nèi)有大量棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)。模型組海馬CA1區(qū)細(xì)胞嚴(yán)重脫失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞體固縮，染色較淡，ChAT陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯減少(P<0.01)。3個(gè)治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組增多、細(xì)胞排列較規(guī)則，固縮細(xì)胞明顯減少，ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元均顯著增多，其中以聯(lián)合組的水平最高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2海馬CA1區(qū)BDNF的表達(dá)假手術(shù)組海馬CA1區(qū)有少量BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，免疫陽(yáng)性顆粒主要分布在胞質(zhì)和細(xì)胞膜表面。模型組海馬CA1區(qū)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯增多(P<0.01)，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色陽(yáng)性顆粒密集深染。3個(gè)治療組免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)均較模型組顯著增多，其中以聯(lián)合組的水平最高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3海馬CA1區(qū)Caspase-3的表達(dá)假手術(shù)組海馬CA1區(qū)有極少量Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)。模型組海馬細(xì)胞脫失，但Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色物質(zhì)增多，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.01)。3個(gè)治療組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，其中以聯(lián)合組的水平最低，與模型組比差異顯著(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT、BDNF及Caspase-3陽(yáng)性

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05，與聯(lián)合組比較：4)P<0.01，5)P<0.01

3討論

腦反復(fù)缺血再灌注損傷和長(zhǎng)期慢性低灌流是VD的主要發(fā)病原因〔4〕。實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際公認(rèn)的改良Pulsinelli 4-VO法，永久性灼斷椎動(dòng)脈并可逆性阻斷頸總動(dòng)脈血流，使大鼠腦處于長(zhǎng)期低灌流狀態(tài)，致腦功能?chē)?yán)重受損，制備出近似人類(lèi)臨床發(fā)病特點(diǎn)的VD大鼠模型〔5〕。

中醫(yī)將VD歸屬于“中風(fēng)”、“呆病”、“善忘”的范疇，認(rèn)為腎虛髓空是VD的根本，心腎不足、肝腎脾虛、氣血虧虛，則腦髓不足、神明失養(yǎng)而致癡呆〔6〕。“腎為先天之本，腎生髓”，“腎俞”穴有益精血、補(bǔ)腦髓，暢活氣血的作用〔6,7〕；“足三里”穴屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，為氣血生化之源〔7〕。穴位埋線法是在祖國(guó)傳統(tǒng)針刺法思路上發(fā)展的另一技術(shù)。腸線作為一種異質(zhì)蛋白，埋入穴位后有持久、柔和的穴位刺激優(yōu)勢(shì)；同時(shí)羊腸線逐漸被機(jī)體吸收，能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)平衡，改善病灶部位血液循環(huán)，增加大腦營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)〔8〕。

海馬作為邊緣系統(tǒng)的組成部分，是學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)和神經(jīng)中樞。記憶突觸就是膽堿能突觸，是學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)〔9〕。海馬對(duì)缺血缺氧極為敏感。當(dāng)膽堿能神經(jīng)元受損時(shí)，腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)—海馬環(huán)路就會(huì)受損，導(dǎo)致癡呆發(fā)生。乙酰膽堿是迄今發(fā)現(xiàn)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系極為密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)〔10〕。 ChAT常作為研究膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志或評(píng)估乙酰膽堿含量的間接指標(biāo)〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此方法具有良好的保護(hù)缺血缺氧狀態(tài)下的海馬膽堿能神經(jīng)元的作用。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)家族重要成員之一，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)。它在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中水平較高，隨著機(jī)體發(fā)育成熟其水平逐漸降低，在缺血缺氧的情況下反應(yīng)性增高，與腦缺血損傷的保護(hù)有關(guān)〔12〕，其高表達(dá)不僅能提高神經(jīng)元抵抗缺血損傷的能力，還能促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建。本文結(jié)果表明BDNF表達(dá)增加是局部腦組織對(duì)缺血損傷的反應(yīng)，而這一反應(yīng)可能也啟動(dòng)了神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制；鹽酸甲氯芬酯聯(lián)合穴位埋線可以很好地加強(qiáng)這一保護(hù)機(jī)制，較單治療組明顯減輕了海馬神經(jīng)元缺血損傷。

海馬結(jié)構(gòu)中各功能亞區(qū)(CA1、CA2、CA3、CA4、齒狀回)神經(jīng)元的丟失可能是血管性癡呆形成的病理學(xué)基礎(chǔ)，其中以CA1區(qū)大錐體細(xì)胞的丟失尤為重要〔13〕。而缺血缺氧所致的神經(jīng)細(xì)胞丟失是以凋亡為主〔14〕。Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，通常情況下Caspase酶原沒(méi)有活性，必須通過(guò)激活，才能誘導(dǎo)凋亡。當(dāng)機(jī)體缺血缺氧時(shí)，凋亡發(fā)生機(jī)制被激活，所有的Caspase家族成員都被剪切，上游Caspase有序地激活下游，將凋亡信號(hào)傳至底物，而下游Caspase-3就是這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的終末執(zhí)行酶。它能降解多種胞內(nèi)蛋白，導(dǎo)致胞體固縮，染色體蹦解，凋亡小體形成〔15〕而發(fā)生細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果表明細(xì)胞凋亡反應(yīng)受到抑制，缺血缺氧所致細(xì)胞損傷減少。

綜上所述，本課題采用中西醫(yī)相結(jié)合的方法對(duì)VD進(jìn)行治療，觀察到大鼠海馬部位ChAT表達(dá)明顯增多，這可能恰與其上調(diào)BDNF水平及下調(diào)Caspase-平有關(guān)。即BDNF提高了神經(jīng)元抵抗缺血損傷的能力，Caspase-3下調(diào)減少了腦細(xì)胞凋亡的程度，二者協(xié)同作用，使缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元得到很好保護(hù)，降低了VD的腦損傷。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：貴陽(yáng)市科技局基金資助(No.T2006-12)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R338.6

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2076-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.012

1暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心

2貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

第一作者：楊瓊(1980-)，女，碩士，講師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。