馬　丞　阿賽古麗

(西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅　蘭州　730030)

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微小RNA(miR)-155對脂多糖所致小鼠急性肺損傷的干預(yù)作用

馬丞阿賽古麗

(西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730030)

〔摘要〕目的探討微小RNA(miR)對脂多糖(LPS)所致小鼠急性肺損傷的干預(yù)作用。方法35只SPF級雄性C57小鼠隨機(jī)分為LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組、空白對照組，每組7只?？瞻讓φ战M不做任何處理；另外四組小鼠建立LPS急性肺損傷模型，LPS致傷后45 min，LPS致傷組行氣管穿刺注入生理鹽水，miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組分別注入0.02 nmol/μl相應(yīng)試劑5 μl。24 h后取完整肺組織，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組中形態(tài)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β mRNA表達(dá)情況，Taqman探針法檢測miR-155表達(dá)情況，Western印跡法檢測環(huán)氧化酶(COX)-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組中TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對照組(P<0.05)，miR-155增強(qiáng)組明顯低于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。miR-155增強(qiáng)組miR-155表達(dá)水平明顯高于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。空白對照組COX-2蛋白表達(dá)量明顯低于另外四組(P<0.05)。結(jié)論miR-155可明顯減弱LPS所致的小鼠急性肺損傷炎癥反應(yīng)。

〔關(guān)鍵詞〕急性肺損傷；微小RNA；脂多糖

目前急性肺損傷多集中于發(fā)病機(jī)制和藥物機(jī)制方面，尚缺乏主動(dòng)特異性治療方法，而特異性治療對于機(jī)體功能偏低的老年急性肺損傷患者具有更重要的意義。相關(guān)研究顯示，通過抑制炎性反應(yīng)和放大效應(yīng)來控制病情進(jìn)展具有較好的可行性〔1〕。微小RNA(miR)是近年來國內(nèi)外基因調(diào)控領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)，已證實(shí)其參與到炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程〔2〕。本次研究建立脂多糖(LPS)小鼠急性肺損傷模型，氣管給藥后檢測肺組織中炎性介質(zhì)表達(dá)情況，擬探討miR-155對急性肺損傷的干預(yù)作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物及材料健康SPF級雄性C57小鼠35只，體重(22±2)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。Trizol試劑(南京安培化工科技有限公司)；miR-155增強(qiáng)劑、抑制劑、對照劑(北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α引物、白細(xì)胞介素(IL)-1β引物(南京森貝伽生物科技有限公司)；miR-155反義探針、U6反義探針、LPS(Sigma公司)；Taq-man miR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(深圳盎然生物科技有限公司)；美國ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量儀，德國Eppendorf高速低溫離心機(jī)。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型將35只C57小鼠隨機(jī)分為LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組、空白對照組，每組7只?？瞻讓φ战M不做任何處理；另外四組小鼠按5 mg/kg劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉，麻醉后切開小鼠頸部皮膚和組織暴露氣管，行氣管穿刺按4 mg/kg劑量向肺中注入20 μg/μl的LPS建立急性肺損傷模型。LPS致傷后45 min，LPS致傷組行氣管穿刺注入生理鹽水，miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組分別注入0.02 nmol/μl相應(yīng)試劑5 μl，頸部皮膚縫合。五組小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)24 h后麻醉，取完整肺組織后斷髓處死。

1.2.2標(biāo)本采集和處理將小鼠左肺上葉在10%的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織損傷程度。剩余的肺組織剪成邊長為1 mm的正方體小塊，錫紙包裹后-80℃保存，用于提取組織蛋白和RNA。

1.2.3TNF-α、IL-1β mRNA、miR-155表達(dá)取小塊肺組織，勻漿后Trizol法提取總RNA。采用綠色熒光染料法實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，檢測TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)情況。cDNA合成條件：37℃、20 min，98℃、10 min，4℃保存；反應(yīng)體系10 μl，其中包括2 μl逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶、1 μl P混合液、6 μl RNA，5倍稀釋備用。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。常規(guī)反應(yīng)條件下40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后繪制溶解曲線，定量分析。采用Taqman探針法實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-155表達(dá)情況。cDNA合成條件：16℃、40 min，42℃、5 min，85℃、5 min，4℃保存；反應(yīng)體系15 μl，100 mmol三磷酸堿基脫氧核苷酸0.2 μl，1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶、2 μl 緩沖液、6 μl RNA，5倍稀釋備用。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 20 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后記錄各組Ct值，定量分析。

1.2.4環(huán)氧化酶(COX)-2蛋白表達(dá)采用Western印跡法檢測：取小塊肺組織，加RIPA蛋白裂解液，提取組織蛋白，蛋白裂解液稀釋至25 mg/ml。按3∶1體積加緩沖液，水浴20 min，聚丙烯酰胺(PAGE)膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉Tris-HCl緩沖液(TBST)封閉60 min。加兔抗鼠COX-2(1∶2 000)，4℃孵育過夜，Tween20/TBS溶液洗滌3次，15 min/次；加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔單克隆抗體，4℃孵育過夜，Tween20/TBS溶液洗滌3次，加發(fā)光液，反應(yīng)10 min后暗室曝光、顯影、定影。β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，Image-Pro Plus軟件測定蛋白表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2結(jié)果

2.1各組小鼠肺組織病理學(xué)變化空白對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整、大小均勻，肺泡腔和肺間質(zhì)未見明顯炎細(xì)胞浸潤。LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組均存在毛細(xì)血管充血，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔存在明顯炎性細(xì)胞浸潤；miR-155增強(qiáng)組肺泡間充血程度，肺泡壁損傷和炎性細(xì)胞浸潤程度輕于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組。見圖1。

2.2各組小鼠TNF-α、IL-1β mRNA、miR-155表達(dá)情況LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組中TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白對照組(P<0.05)，造模成功。miR-155增強(qiáng)組TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯低于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。miR-155增強(qiáng)組miR-155表達(dá)水平明顯高于LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組(P<0.05)。見表1。

圖1　各組小鼠肺組織病理學(xué)變化情況(HE，×40)

組別TNF-αIL-1βmRNAmiR-155LPS致傷組25.58±4.531)2)56.85±4.611)2)0.83±0.102)miR-155抑制組39.81±4.321)2)63.82±5.081)2)1.18±0.462)miR對照組37.10±4.971)2)60.18±5.371)2)0.91±0.292)miR-155增強(qiáng)組13.67±3.171)26.44±4.381)165.26±17.95空白對照組1.15±0.521.22±0.551.03±0.37

與空白對照組相比：1)P<0.05；與miR-155增強(qiáng)組相比：2)P<0.05

2.3各組小鼠COX-2蛋白表達(dá)水平比較空白對照組COX-2蛋白表達(dá)量為(0.74±0.08)；LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組COX-2蛋白表達(dá)量分別為(1.05±0.07)、(1.07±0.10)、(1.02±0.04)、(0.88±0.08)?？瞻讓φ战MCOX-2蛋白表達(dá)量明顯低于另外四組(P<0.05)。見圖2。

1～5分別為：LPS致傷組、miR-155抑制組、miR對照組、miR-155增強(qiáng)組、空白對照組圖2　Western印跡檢測各組小鼠肺組織中COX-2蛋白表達(dá)

3討論

miR可維持生物機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)，調(diào)節(jié)生長發(fā)育，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究顯示，miR-155可參與機(jī)體對炎性介質(zhì)的免疫應(yīng)答，維持免疫功能的正?！?〕。相關(guān)基礎(chǔ)研究認(rèn)為，miR-155作用于靶基因抑制性KB激酶(IKK)家族相關(guān)死亡域蛋白，減弱核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性，按照次級效應(yīng)方式對炎性因子的釋放產(chǎn)生抑制效果，降低機(jī)體損傷〔4〕。由于大鼠miR給藥劑量較大，為控制研究成本，本次研究采用小鼠急性肺損傷模型，與以往該領(lǐng)域多數(shù)采用的急性肺損傷實(shí)驗(yàn)大鼠模型不同。急性肺損傷病理生理過程中會(huì)分泌大量的炎性因子(如TNF-α、IL-1β)〔5〕。COX-2蛋白是發(fā)生炎性反應(yīng)的關(guān)鍵酶，當(dāng)多種刺激因素作用于細(xì)胞時(shí)，其表達(dá)水平明顯上升〔6〕。本文顯示，LPS會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織分泌大量TNF-α、IL-1β，COX-2蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，在給予小鼠氣管注射miR-155增強(qiáng)劑后，TNF-α、IL-1β mRNA和COX-2蛋白表達(dá)均降低，但轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑之后上述指標(biāo)表達(dá)不明顯，可能與miR-155基礎(chǔ)量不高有關(guān)；HE染色結(jié)果說明miR-155能夠有效抑制LPS引發(fā)的急性肺損傷炎性反應(yīng)。相關(guān)研究顯示，miR-155靶向抑制髓樣分化因子為NF-κB信號通路的連接蛋白，能夠?qū)τ拈T螺旋桿菌導(dǎo)致的炎性反應(yīng)起到負(fù)調(diào)控作用〔7〕。在急性肺損傷模型中，miR-155能否通過抑制髓樣分化因子減弱炎性反應(yīng)，需進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-08-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目(No.2014A-088)

通訊作者：阿賽古麗(1972-)，女，博士，教授，主要從事臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

〔中圖分類號〕R563

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09--；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.006

第一作者：馬丞(1993-)，男，碩士，主要從事臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。