王先麗　陳龍菊

(湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北　恩施　445000)

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五鶴續(xù)斷對(duì)衰老小鼠免疫功能的影響

王先麗陳龍菊1

(湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的觀察五鶴續(xù)斷(WHDA)注射液對(duì)衰老小鼠免疫功能的影響。方法昆明種小鼠(雌雄各半)50只，隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組及對(duì)照組，每組10只。對(duì)照組按500 mg·kg-1·d-1腹腔注射生理鹽水，其他各組注射等量D-半乳糖。高、中及低劑量組在注射D-半乳糖的同時(shí)按7.2、3.6及1.8 g·kg-1·d-1腹腔注射WHDA，模型組、對(duì)照組注射等量生理鹽水。連續(xù)飼養(yǎng)30 d后處死小鼠，取出胸腺、脾臟測(cè)定指數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)各組小鼠血清中免疫球蛋白(Ig)G、IgM、C3及C4，采用細(xì)胞流式儀分析脾細(xì)胞主要T細(xì)胞亞群。結(jié)果模型組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)明顯下降(P<0.05)，WHDA高、中劑量組明顯增大(P<0.05)；模型組血清中IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4含量減少顯著(P<0.05)，WHDA高、中劑量組增加明顯(P<0.05)；模型組CD3+、CD4+及CD44+細(xì)胞數(shù)量減少顯著(P<0.05)，CD8+數(shù)量明顯增加(P<0.05)，WHDA高、中劑量組CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)量增加明顯(P<0.05)，高劑量組CD8+細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)，高劑量組CD44+細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。結(jié)論WHDA對(duì)衰老小鼠胸腺、脾臟萎縮有一定的延緩作用，能提高血清中IgG、IgM、C3及C4含量，改善脾臟功能，影響T細(xì)胞亞群的比例，對(duì)免疫所致衰老有較好的作用。

〔關(guān)鍵詞〕五鶴續(xù)斷；免疫球蛋白；補(bǔ)體

五鶴續(xù)斷(WHDA)是生長(zhǎng)在湖北省五峰縣和鶴峰縣的川續(xù)斷科草本植物，又名龍豆，因地理生態(tài)環(huán)境富硒、產(chǎn)量大、質(zhì)量?jī)?yōu)而聞名，是名副其實(shí)的道地藥材〔1〕，其成分含有三萜皂苷類、揮發(fā)油、甾醇類、生物堿、黃酮等有效成分，具有補(bǔ)肝益腎、續(xù)接筋骨、抗骨質(zhì)疏松等功效〔2〕。研究表明，WHDA有清除體內(nèi)活性氧，減少丙二醛(MDA)產(chǎn)生，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力，具有抗氧化、抗疲勞及抗衰老等作用〔3～5〕。本文觀察WHDA對(duì)衰老小鼠免疫功能的影響，從免疫學(xué)方面探討WHDA抗衰老機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料清結(jié)級(jí)昆明種小鼠(雌雄各半)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，4～6周齡，體重(20.6±2.8)g，由常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2藥品及儀器WHDA由湖北省恩施市板橋鄉(xiāng)中藥材生產(chǎn)基地提供，采用水提醇沉法制成含生藥30%(相當(dāng)于生藥含量2 g/ml)的液體,用時(shí)以生理鹽水稀釋成0.4 g/ml，瓶裝密封消毒貯存于4℃?zhèn)溆谩?〕。D-半乳糖(Sigma公司)，PE標(biāo)記的抗大鼠CD3、CD8抗體及(FITC)標(biāo)記的抗大鼠CD4、CD44抗體(Biolegend公司)，免疫球蛋白(Ig)G、IgM、C3、C4 ELISA試劑盒(晶美公司)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)，其他分析純?cè)噭┯珊倍魇?lè)之塬科技公司提供。FA1640型精密電子天平(上海天平儀器廠)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，低溫冷凍離心機(jī)及流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)。

1.3動(dòng)物分組、造模及給藥將清潔級(jí)昆明種小鼠(雌雄各半)50只，隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組及對(duì)照組，每組10只。對(duì)照組按500 mg·kg-1·d-1腹腔注射生理鹽水，其他各組注射等量D-半乳糖〔6〕。高劑量組、中劑量組及低劑量組在注射D-半乳糖的同時(shí)按7.2、3.6及1.8 g·kg-1·d-1腹腔注射WHDA，模型組、對(duì)照組注射等量生理鹽水。各組自由飲食，連續(xù)飼養(yǎng)30 d。

1.4胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定75%乙醇消毒后，小心取出胸腺、脾臟，放入冰凍生理鹽水(0.9%)沖洗拭干，迅速用精密分析天平稱取重量，測(cè)定胸腺、脾臟指數(shù)〔胸腺、脾臟重量(mg)/體重(g)〕。

1.5酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)WHDA對(duì)小鼠IgG、IgM、C3及C4的影響小心收集小鼠血液于無(wú)內(nèi)毒素、熱原的促凝管中，4℃，10 000 r/min離心15 min，于-70℃保存?zhèn)溆?。血清中IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4檢測(cè)參考試劑盒說(shuō)明書(shū)采用雙抗體夾心ELISA法。

1.6脾細(xì)胞中主要T細(xì)胞亞群的分析將取出的脾臟，放入培養(yǎng)皿中，將其周圍結(jié)締組織剪除，加入10 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH7.4)反復(fù)沖洗后轉(zhuǎn)至200目濾網(wǎng)培養(yǎng)皿中加入5 ml PBS，仔細(xì)研磨制成單個(gè)細(xì)胞懸液。2 000 r/min離心12 min，棄上清后加入5 ml紅細(xì)胞裂解液，1 500 r/min離心8 min，再棄上層清液，重復(fù)3次〔7,8〕。沉淀用無(wú)血清Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液離心洗滌3次后重懸于PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性檢測(cè)。依據(jù)檢測(cè)的T細(xì)胞亞群的不同，加入50 μl稀釋后的用PE標(biāo)記的抗大鼠CD3、CD8及用FITC標(biāo)記的抗大鼠CD4、CD44一抗1 μg在相應(yīng)的流式檢測(cè)管中，對(duì)照管則加入50 μl緩沖液。各管再分別加入50 μl細(xì)胞懸液混勻后4℃孵育30 min，離心洗滌3次后取500 μl上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1WHDA對(duì)胸腺、脾臟指數(shù)的影響模型組相對(duì)對(duì)照組，胸腺、脾臟指數(shù)明顯下降(P<0.05)；WHDA各組與模型組相比較，高、中劑量組胸腺、脾臟指數(shù)明顯增大(P<0.05)，低劑量組增大不明顯，無(wú)顯著差異(P>0.05)；WHDA各組與對(duì)照組相比，高劑量組胸腺、脾臟指數(shù)有所增大(P<0.05)，中、低劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2WHDA對(duì)血清IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4的影響與對(duì)照組相比較，模型組小鼠血清中IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4含量減少顯著(P<0.05)；WHDA各組與模型組相比較，高、中劑量組血清中IgG、IgM及補(bǔ)體C3、C4含量增加明顯(P<0.05)；WHDA各組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1　WHDA對(duì)各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

與模型組比較：1)P<0.05；與對(duì)照組比較：2)P<0.05，下表同

表2　WHDA對(duì)血清IgG、IgM及補(bǔ)體

2.3WHDA對(duì)脾細(xì)胞中主要T細(xì)胞亞群的影響與對(duì)照組相比較，模型組小鼠CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+輔助T淋巴細(xì)胞及CD44+記憶性T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少顯著(P<0.05)，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)；WHDA各組與模型組相比較，高、中劑量組CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+輔助T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加明顯(P<0.05)，高劑量組CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P<0.05)，中、低劑量組CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化不明顯，高劑量組CD44+記憶性T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)；中、低劑量組CD44+記憶性T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化不明顯；WHDA各組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3　WHDA對(duì)各組小鼠脾細(xì)胞中主要T細(xì)胞

3討論

衰老是生物自發(fā)必然的生理現(xiàn)象，可表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上的退行性變，功能的衰退，適應(yīng)性及抵抗力下降，目前對(duì)衰老有多種假說(shuō)，其中有免疫學(xué)說(shuō)及中醫(yī)脾虛衰老學(xué)說(shuō)〔7～9〕。免疫衰老是極為復(fù)雜的過(guò)程，常常會(huì)伴隨免疫指標(biāo)的改變。作為重要免疫器官胸腺、脾臟，對(duì)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分化、發(fā)育、體液免疫及細(xì)胞免疫有重要作用，胸腺、脾臟指數(shù)常來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫功能〔10，11〕；Ig則是評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫狀況的常用指標(biāo)，其含量多少基本可反映機(jī)體免疫應(yīng)答能力和體液免疫水平，免疫衰老常見(jiàn)的改變還有T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)量和功能的減退〔12〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WHDA衰老小鼠胸腺、脾臟萎縮有一定的延緩作用，表明WHDA對(duì)免疫器官有一定的修復(fù)作用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫器官抗衰老；WHDA能提高衰老小鼠血清中的含量，對(duì)提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力和體液免疫水平有一定的作用；WHDA可以改善小鼠的脾臟功能，影響T細(xì)胞亞群的比例，通過(guò)增加不同類型T細(xì)胞的數(shù)量來(lái)增強(qiáng)免疫功能，發(fā)揮抗衰老作用。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯馮超/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：恩施州農(nóng)業(yè)與社會(huì)發(fā)展科技指導(dǎo)性計(jì)劃(恩州科業(yè)〔2013〕9號(hào))

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)09-2059-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.004

1湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院

第一作者：王先麗(1980-)，女，碩士，講師，主要從事病理生理學(xué)研究。