孟慶玲,貢莎莎,喬 軍,趙海龍,張星星,羅建勛 ,朱興全
(1 .石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子 832003;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046)
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不同保存方法對(duì)少孢節(jié)叢孢菌存活及捕食活性的影響
孟慶玲1,貢莎莎1,喬軍1,趙海龍1,張星星1,羅建勛2,朱興全2
(1 .石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子832003;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州730046)
摘要為了探討少孢節(jié)叢孢菌分生孢子及菌絲長(zhǎng)期保存方法,以分生孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)生捕食器和捕食能力為指標(biāo),比較少孢節(jié)叢孢菌分生孢子及菌絲在不同保存條件下的保存效果。結(jié)果表明,在3種保存溶液中、-20 ℃條件下凍存3 a的分生孢子沒(méi)有萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲,而在4 ℃條件下保存3 a的分生孢子仍可以萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲,且能產(chǎn)生捕食器捕食線蟲(chóng)。在固體培養(yǎng)基CMA和YPSSA生長(zhǎng)的菌絲于-20 ℃或4 ℃條件下保存2 a,菌絲仍可生長(zhǎng)并產(chǎn)生捕食器捕食線蟲(chóng);但在-20 ℃保存2 a的菌絲復(fù)蘇后接種對(duì)綿羊糞便中線蟲(chóng)的捕食活性較凍存前有所下降。研究結(jié)果提示,少孢節(jié)叢孢菌分生孢子可在3種保存溶液中4 ℃條件下及在固體培養(yǎng)基CMA、YPSSA中于-20 ℃或4 ℃條件下均可長(zhǎng)期保存,但在3種保存溶液中4 ℃條件下菌株的捕食活性最高。
關(guān)鍵詞少孢節(jié)叢孢菌;捕食線蟲(chóng)性真菌;菌種保存
家畜線蟲(chóng)病是由線形動(dòng)物門線蟲(chóng)綱所屬各種寄生性線蟲(chóng)寄生于家畜所引起的一類疾病,目前,主要采取化學(xué)藥物防控該病。然而,隨著化學(xué)驅(qū)蟲(chóng)藥的長(zhǎng)期使用而產(chǎn)生的抗藥性、藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題日益嚴(yán)重,迫切需要尋找一種新的方法將寄生性線蟲(chóng)控制在較低的危害水平,以獲得最佳的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益[1-6]。目前,最有應(yīng)用前景的是利用寄生性線蟲(chóng)的天敵——捕食線蟲(chóng)性真菌進(jìn)行生物防治[7-8]。捕食線蟲(chóng)性真菌在自然界中分布很廣。近幾年,對(duì)捕食線蟲(chóng)性真菌生態(tài)學(xué)和臨床應(yīng)用等方面的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有極大的利用空間和潛在的市場(chǎng)價(jià)值。長(zhǎng)期保存捕食線蟲(chóng)性真菌菌種并使其保持捕食活性是研發(fā)生物防控制劑的前提。現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室保存捕食線蟲(chóng)性真菌的方法有如連續(xù)轉(zhuǎn)接法、土壤保存法、液氮保存法等,然而這些方法都存在一定的弊端:連續(xù)轉(zhuǎn)接,易發(fā)生污染并導(dǎo)致菌株生物活性發(fā)生改變,捕食能力下降;土壤保存則費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且不易再次重新進(jìn)行純化分離;而液氮保存則需要一定條件,操作麻煩。因此,本試驗(yàn)對(duì)捕食線蟲(chóng)性真菌的代表菌——少孢節(jié)叢孢菌在不同保存條件下,通過(guò)比較保存前后菌株分生孢子及菌絲的復(fù)蘇、捕食器產(chǎn)生能力和捕食活性,以期探討不同保存方法對(duì)少孢節(jié)叢孢菌捕食活性的影響,為進(jìn)一步研發(fā)防控家畜消化道線蟲(chóng)病的生防制劑奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1儀器、試劑及培養(yǎng)基
霉菌培養(yǎng)箱、冰箱、倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、冷凍管、瓊脂粉和新鮮玉米粉等由石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。CMA 、YPSSA和玉米粒培養(yǎng)基參照考桂蘭等[9]提供的方法制備。
1.2保存溶液或介質(zhì)
0.4 g/L玉米粉 CMA培養(yǎng)基,YPSSA培養(yǎng)基,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80溶液,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80-5%甘油溶液,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80-10%聚乙二醇溶液。
1.3少孢節(jié)叢孢菌及其分生孢子
所用菌株來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室保存的9株少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)分別命名為A-XJ1、B-XJ2、C-XJ3、D-XJ4、H-XJ8、J-XJ10、K-XJ11、L-XJ12和M-XJ13。將9株少孢節(jié)叢孢菌分別接種于CMA培養(yǎng)基中,于真菌培養(yǎng)箱 21 ℃培養(yǎng)7 d后,將培養(yǎng)基切成小塊,轉(zhuǎn)接于玉米粒培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d后,分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80-5%甘油溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80-10%聚乙二醇溶液洗脫,即獲得分生孢子,調(diào)整分生孢子的數(shù)量為5×105mL-1。
1.4誘餌線蟲(chóng)分離與純化
采集綿羊真胃中寄生的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)雌蟲(chóng),取出蟲(chóng)卵于24 ℃培養(yǎng)12 d,參照王為升[10]的貝爾曼氏法分離第3期幼蟲(chóng)(L3),在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù),并調(diào)整幼蟲(chóng)混懸液的含量為2 000 mL-1,4 ℃冰箱保存,備用。
1.5含捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)卵羊糞的收集
選擇3只健康的綿羊單獨(dú)飼喂,口服阿苯達(dá)唑驅(qū)蟲(chóng),1周后,用布兜懸空法收集羊糞,用漂浮法檢查羊糞中蟲(chóng)卵情況,直至蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)陰為止。用H.contortusL3感染綿羊(每只20 000條),23~30 d時(shí)收集羊糞,備用。
1.6不同保存溶液及溫度對(duì)少孢節(jié)叢孢菌分生孢子的影響
在5 mL冷凍管中分別加入“1.3”中獲得的 9株少孢節(jié)叢孢菌分生孢子懸液2 mL,于 -20 ℃冰箱凍存3 a后,取出融化搖勻,用移液器取20 μL于載玻片上,蓋上蓋玻片,鏡下觀察分生孢子的形態(tài)。同時(shí)接種于CMA培養(yǎng)基上,觀察分生孢子有無(wú)萌發(fā)、有無(wú)菌絲長(zhǎng)出。同時(shí),將9株少孢節(jié)叢孢菌分生孢子懸液于4 ℃保存3 a后,取出,用移液器取20 μL于載玻片上,蓋上蓋玻片,鏡下觀察分生孢子的形態(tài)。同時(shí)接種于CMA培養(yǎng)基上,觀察分生孢子有無(wú)萌發(fā)、有無(wú)菌絲長(zhǎng)出。若有菌絲生長(zhǎng),滴加誘餌線蟲(chóng)H.contortusL3進(jìn)行誘導(dǎo),顯微鏡下觀察其有無(wú)捕食器產(chǎn)生及有無(wú)幼蟲(chóng)被捕食。
1.7不同保存介質(zhì)及溫度對(duì)少孢節(jié)叢孢菌的影響
將9株少孢節(jié)叢孢菌分別轉(zhuǎn)接于CMA培養(yǎng)基和YPSSA培養(yǎng)基中,待菌絲長(zhǎng)滿平皿,用封口膜封好平皿,分別于-20 ℃和4 ℃保存2 a后取出,再分別轉(zhuǎn)接于CMA培養(yǎng)基,置于21 ℃真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng),觀察菌絲生長(zhǎng)情況,若有菌絲生長(zhǎng),滴加誘餌線蟲(chóng)-H.contortusL3進(jìn)行誘導(dǎo),顯微鏡下觀察其有無(wú)捕食器產(chǎn)生及有無(wú)幼蟲(chóng)被捕食。
1.8少孢節(jié)叢孢菌對(duì)綿羊糞便中H.contortusL3捕食活性影響的測(cè)定
將在-20 ℃條件下保存2 a的9株少孢節(jié)叢孢菌,解凍后分別轉(zhuǎn)接于CMA培養(yǎng)基,待菌絲長(zhǎng)滿平皿后,分別切塊轉(zhuǎn)接于玉米粒培養(yǎng)基中,于真菌培養(yǎng)箱 21 ℃培養(yǎng)25 d后,用含0.05%吐溫-80洗脫液洗脫分生孢子,最終配成5×105mL-1分生孢子懸液。將收集的綿羊糞碾碎,混合均勻后分成10組,其中1個(gè)對(duì)照組,9個(gè)試驗(yàn)組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)100 g糞便,置于平皿內(nèi),每組羊糞加入1株少孢節(jié)叢孢菌的分生孢子懸液1 mL,后放在21 ℃下避光培養(yǎng)。10 d后采用貝爾曼氏幼蟲(chóng)分離法收集各組幼蟲(chóng)。統(tǒng)計(jì)各組幼蟲(chóng)數(shù)(LPG),計(jì)算捕食率。捕食率=(對(duì)照組LPG-試驗(yàn)組LPG)/對(duì)照組LPG×100%。與動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期做的少孢節(jié)叢孢菌對(duì)糞中幼蟲(chóng)捕食率[10]進(jìn)行比較,觀察凍存前后少孢節(jié)叢孢菌捕食能力是否發(fā)生變化。
2結(jié)果與分析
2.1不同保存溶液及溫度對(duì)少孢節(jié)叢孢菌分生孢子的影響
少孢節(jié)叢孢菌分生孢子在0.05%吐溫-80溶液、0.05%吐溫-80-5%甘油溶液、0.05%吐溫-80-10%聚乙二醇溶液、0.05%吐溫-80溶液、0.05%吐溫-80-5%甘油溶液、0.05%吐溫-80-10%聚乙二醇溶液條件下保存3 a后的萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)生捕食器及捕食情況見(jiàn)表1。
在3種保存溶液中,在-20 ℃條件下凍存3 a 的9株少孢節(jié)叢孢菌分生孢子,在顯微鏡下均可看到清晰的分生孢子:分生孢子有隔無(wú)色雙胞,呈梨形,分隔處稍縊縮,大小為23 μm×13 μm(圖1-A);但是接種到CMA培養(yǎng)基后,均未萌發(fā),無(wú)菌絲生長(zhǎng)。
在3種保存溶液中,4 ℃條件下保存3 a的9株少孢節(jié)叢孢菌分生孢子,鏡下觀察均可見(jiàn)分生孢子,分生孢子呈梨形,有隔無(wú)色雙胞,分隔處稍縊縮。接種到CMA培養(yǎng)基后分生孢子萌發(fā)率達(dá)到90% 以上(圖1-B)。加入誘餌線蟲(chóng)H.contortusL3后菌絲可以產(chǎn)生捕食器,并且可以捕食H.contortusL3(圖1-C、D)。
表1 少孢節(jié)叢孢菌分生孢子在各種保存條件下的萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)生捕食器及捕食活性
注:“+”表示試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性,“-”表示試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
Note:“+” shows the test result is positive,“-” shows the test result is negative.
A.保存于-20 ℃的分生孢子形態(tài)Morphological characteristics of conidia stored at -20 ℃;B. 保存于4 ℃的分生孢子經(jīng)培養(yǎng)后萌發(fā)情況Spore germination saved at 4 ℃;C. 分生孢子萌發(fā)后菌絲特化形成捕食器Spores germinate to form predator;D. 特化形成的捕食器對(duì)線蟲(chóng)的捕獲Capture of nematodes by specialized predator
圖1-20 ℃和4 ℃條件下保存對(duì)9株少孢節(jié)叢孢菌分生孢子形態(tài)及生存能力的影響
Fig.1Effects of 4 ℃ or -20 ℃ on conidia and germination of 9 strains ofA.oligospora
2.2不同保存介質(zhì)及溫度對(duì)少孢節(jié)叢孢菌生存能力的影響
在2種固體保存介質(zhì)中,-20 ℃條件下凍存2 a的9株少孢節(jié)叢孢菌解凍后分別接種于CMA培養(yǎng)基,9株菌全部有菌絲生長(zhǎng),菌絲為白色,發(fā)達(dá),呈密集的絲狀體,在培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)或培養(yǎng)基質(zhì)表面呈樹(shù)枝狀延伸生長(zhǎng);菌絲粗細(xì)不均,主干菌絲稍粗,分枝菌絲稍細(xì),菌絲無(wú)色有隔,并且距離不等(圖2-A);加入誘餌線蟲(chóng)后有少量的單個(gè)菌環(huán)產(chǎn)生(圖2-B),隨后在單個(gè)菌環(huán)上又長(zhǎng)出2~3個(gè)菌環(huán),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),菌環(huán)增多,形成三維菌網(wǎng)(圖2-C);產(chǎn)生的菌環(huán)或菌網(wǎng)可粘住或套住誘餌線蟲(chóng)(圖2-D)。在2種固體保存介質(zhì)中,在4 ℃條件下凍存2 a的9株少孢節(jié)叢孢菌分別接種于CMA培養(yǎng)基,9株菌的生存能力與“2.2.1” 相同,也可以產(chǎn)生捕食環(huán)或捕食網(wǎng),可對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行捕食。
2.3少孢節(jié)叢孢菌對(duì)綿羊糞便中H.contortusL3捕食活性的影響
將在-20 ℃條件下保存2 a的9株少孢節(jié)叢孢菌,解凍后分別轉(zhuǎn)接于CMA培養(yǎng)基,待菌絲長(zhǎng)滿平皿后,分別切塊轉(zhuǎn)接于玉米粒培養(yǎng)基中,于真菌培養(yǎng)箱 21 ℃培養(yǎng)25 d后,用含0.05%吐溫-80溶液洗脫分生孢子,將分生孢子與羊糞混合。結(jié)果9株菌對(duì)糞便中H.contortusL3的捕食活性全部降低,但降低程度存在差異(圖3);其中保存前活性最高的A-XJ1株,捕食活性從97.6%下降到83.3%,下降最明顯;而保存前活性相對(duì)較低的J-XJ10株捕食活性下降最少,只下降了1.4%;K-XJ11捕食活性下降幅度最大,達(dá)到14.4%;此外,捕食活性下降幅度比較大的還有B-XJ2、D-XJ4,下降幅度均在10%以上。
A. 解凍后接種于CMA培養(yǎng)基的菌絲呈樹(shù)枝狀延伸生長(zhǎng)Hyphae inoculated CMA extending dendritic growth after thawing the culture medium;B. 加入H.contortusL3誘導(dǎo)12 h后產(chǎn)生的捕食環(huán)H.contortusL3 induces prey ring after 12 h;C. 加入H.contortusL3誘導(dǎo)24 h后產(chǎn)生的捕食菌網(wǎng)H.contortusL3 induces prey network after 24 h;D.H.contortusL3被捕食器捕獲H.contortusL3 captured by prey network
圖2-20 ℃條件下保存于YPSSA培養(yǎng)基的菌株存活及捕食結(jié)構(gòu)產(chǎn)生情況
Fig.2Effects of YPSSA medium on conidia and germination ofA.oligospora
圖3 保存前后9株少孢節(jié)叢孢菌對(duì)綿羊糞便中H.contortus L3捕食活性的比較
3討 論
在捕食線蟲(chóng)性真菌生物制劑研發(fā)中,如何長(zhǎng)期保存真菌菌種,并且保持其捕食能力,是真菌研究者非常關(guān)注的問(wèn)題。本試驗(yàn)探討了在常規(guī)的保存條件下少孢節(jié)叢孢菌分生孢子被保存3 a后及菌絲被保存2 a后的生存能力和捕食能力,發(fā)現(xiàn)分生孢子-20 ℃凍存3 a后雖保持固有形態(tài),但其活力喪失。在前期的預(yù)試驗(yàn)中,曾將分生孢子于-20 ℃凍存5 d,解凍后,轉(zhuǎn)接于CMA培養(yǎng)基,分生孢子可以萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲,并且可以產(chǎn)生捕食器捕食線蟲(chóng);這與考桂蘭等[10]研究結(jié)果一致。少孢節(jié)叢孢菌分生孢子在3種保存溶液中、4 ℃條件保存3 a后,分生孢子仍保持活力,能夠長(zhǎng)出菌絲,產(chǎn)生捕食器捕食線蟲(chóng)。證實(shí)4 ℃條件下可長(zhǎng)期保存分生孢子,此種保藏方法簡(jiǎn)便易行,費(fèi)用低廉,菌種保存時(shí)間長(zhǎng)而不需要其他處理,適用于大批量的菌種長(zhǎng)期保存,為今后實(shí)驗(yàn)室保存少孢節(jié)叢孢菌分生孢子提供了依據(jù)。
在本試驗(yàn)中,9株少孢節(jié)叢孢菌在2種固體保存介質(zhì)中,-20 ℃或4 ℃ 保存2 a后分別接種于CMA培養(yǎng)基,9株菌全部有菌絲生長(zhǎng),且能產(chǎn)生捕食器捕食誘餌線蟲(chóng)。有些真菌室采用了一些菌株保存法有:移種傳代保存法、液體石蠟覆蓋保存法、低溫冰箱保存法、冷凍干燥保存法等。但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)踐后發(fā)現(xiàn),這些方法都不太理想,原因是:①菌株易發(fā)生變異;②費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)資金;③融化后的菌種不能再次低溫冰箱冷凍保存;④操作復(fù)雜, 需要昂貴的儀器設(shè)備[11-14]。因真菌的種類繁多,每種真菌有其自身的特點(diǎn),為了尋找適合少孢節(jié)叢孢菌的保存方法,本實(shí)驗(yàn)室在前期工作的基礎(chǔ)上,選用菌絲作為菌種在固體培養(yǎng)基中保存,結(jié)果表明在-20 ℃或4 ℃ 保存2 a后的少孢節(jié)叢孢菌仍保持活力。
為了探討少孢節(jié)叢孢菌長(zhǎng)期低溫保存后其捕食活性的變化,本試驗(yàn)將擴(kuò)繁的分生孢子與羊糞混合培養(yǎng),結(jié)果表明9株少孢節(jié)叢孢菌對(duì)羊糞中H.contortusL3的捕食活性均有不同程度的降低,其中有5株的捕食活性降低10%以上,另外4株的捕食活性下降小于10%。試驗(yàn)所用9株分離自新疆不同地區(qū)[9,15],由于不同生態(tài)環(huán)境對(duì)少孢節(jié)叢孢菌具有不同的遺傳背景,因此從不同地區(qū)分離的少孢節(jié)叢孢菌可能在溫度的適應(yīng)性方面存在差異,導(dǎo)致不同的菌株對(duì)低溫的耐受性不同。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研發(fā)防控家畜消化道線蟲(chóng)病的生防制劑奠定了前期基礎(chǔ)。
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Received 2015-06-05Returned2015-07-18
Foundation itemSupported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31260601,No.31460654); the Doctoral Research Fund of Xinjiang Production and Construction Corps (No. 2010JC09); Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interests (No. 201303037).
First authorMENG Qingling, female, Ph.D,professor.Research area:animal parasitology.E-mail:2448986506@qq.com
(責(zé)任編輯:潘學(xué)燕Responsible editor:PAN Xueyan)
Effects of Different Methods for Fungi Preservation on Germination and Predation Activity ofArthrobotrysoligospora
MENG Qingling1, GONG Shasha1, QIAO Jun1, ZHAO Hailong1,ZHANG Xingxing1, LUO Jianxun2and ZHU Xingquan2
(1.Department of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi Xinjiang832003, China;2.Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730046, China)
AbstractTo explore the best preservation method of spores and hyphae for prolonging its effective preservation period, methods and conditions for Arthrobotrys oligospora (A.oligospora) were studied by comparing the different indexes of spore germination, predator generation and predatory activity before and after preservation of strain. Among the three preservation solution, there was no germination for spores under conditions of -20 ℃ for three years, while spores germinated and produced prey predator at 4 ℃ for three years. Mycelium of A.oligospora grew on solid medium CMA and YPSSA at -20 ℃ or 4 ℃ for 2 years, and mycelium grew well after the transferring on CMA. However, predatory activity of strains of A.oligospora recovered from which were stored at -20 ℃,2 years was significantly declined in sheep feces than that of activity before preservation. The results showed that spores can be preserved in three kinds of preservation solution at 4 ℃ for long-term preservation, and mycelial can be preserved on solid medium CMA and YPSSA at -20 ℃ or 4 ℃ for a long time, but it's predator activity could be affected.
Key wordsArthrobotrys oligospora; Nematode-trapping fungi; Species preservation
Corresponding authorQIAO Jun, male,Ph.D,professor.Research area:pathogenic biology in livestock. E-mail:xjmqlqj@163.com
中圖分類號(hào)S852.7
文獻(xiàn)標(biāo)志碼A
文章編號(hào)1004-1389(2016)03-0347-06
通信作者:?jiǎn)誊?,男,博士,教授,研究方向?yàn)樾笄莶≡飳W(xué)。E-mail:xjmqlqj@163.com
基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31260601,31460654);兵團(tuán)博士基金(2010JC09);國(guó)家公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)專項(xiàng)(201303037)。
收稿日期:2015-06-05修回日期:2015-07-18
網(wǎng)絡(luò)出版日期:2016-03-06
網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.010.html
第一作者:孟慶玲,女,博士,教授,研究方向?yàn)閯?dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)。E-mail:2448986506@qq.com